黏质沙雷氏菌磷脂酶A_(1)辅助蛋白PlaS对宿主菌细胞膜的影响及亚细胞定位

为证明黏质沙雷氏菌磷脂酶A_(1)辅助蛋白PlaS在大肠杆菌BL21(DE3)异源表达中对细胞膜有明显的破坏作用,探究了细胞膜特性的变化,并采用气相色谱-质谱联用技术鉴定了其对细胞膜脂肪酸的影响,通过激光共聚焦显微镜验证了亚细胞水平定位。结果显示:PlaS异源表达后,宿主菌内外膜通透性明显提高、细胞膜流动性与表面疏水性严重下降,表明细胞膜功能已经丧失;脂肪酸饱和程度下降,即直链饱和脂肪酸和反式单不饱和脂肪酸相对含量降低,以及顺式单不饱和脂肪酸相对含量增加、膜刚性增强、流动性减少,细胞膜组分与结构表现异常导致细胞易死亡。激光共聚焦显微镜显示,在宿主细胞膜上发现明显荧光。综上所述,PlaS属于膜蛋白,在大肠杆菌异源表达中会破坏宿主菌细胞膜的结构与功能,表现生长抑制现象,这将为进一步PlaS抑制机理的研究与其功能开发提供一定支持。

内蒙古绒山羊角蛋白辅助蛋白1.1基因真核表达载体构建及基因转染

试验通过提取绒山羊皮肤总RNA,克隆角蛋白辅助蛋白1.1(keratin-associated protein 1.1,KAP1.1)基因,构建重组真核表达载体pEGFP-N3-KAP1.1,利用脂质体介导法将重组质粒转入内蒙古绒山羊体外培养的成纤维细胞中,研究该基因在真核细胞中的时空表达、亚细胞定位及表达规律。结果显示,2.0μg重组质粒和6.0μL脂质体的比例为适合本试验的最优化方案,KAP1.1基因能在内蒙古绒山羊成纤维细胞中成功表达,并在转染后48h转染率达到峰值,该基因在真核体外培养细胞中细胞核、细胞质和细胞膜上均有表达,但以细胞核表达量最强。

3个山羊品种角蛋白辅助蛋白7基因的遗传多态性分析

本研究采用PCR-SSCP方法对陕北白绒山羊、太行黑山羊及南疆绒山羊的角蛋白辅助蛋白(keratin-associated pro-teins,KAP)7基因进行遗传多态性研究。结果显示,KAP7基因在3个山羊品种中有多态性,有AA和AB 2种基因型,AA基因型均为其优势基因型。测序结果发现,KAP7基因在129bp处存在C→G的突变,突变的位置位于5′调控区。

辅助蛋白基因的剪接对磷脂酶A1酶活的影响

为探究磷脂酶A1辅助蛋白(phospholipase A1 accessory protein,PlaS)对磷脂酶A1(phospholipase A1,PlaA1)酶活关键调控区域,根据PlaS的结构特点,设计出截短突变体,利用聚合酶链式反应技术将PlaA1与PlaS共表达基因plaB中编码辅助蛋白的基因plaS进行了剪接,并对各截短菌株进行酶活检测和酶学性质分析。结果表明:PlaS属于锚蛋白(ankyrin,ANK)家族,主要由N端域、ANK结构域、C端域三部分组成,其中ANK结构域包含4个典型的ANK重复序列(ANK repeat)。从构建的5株截短菌株中筛选出了2株胞外酶活相对较高的菌株AN-3与AN-4,与未截短菌株BP28相比,比酶活分别提高了73%和78%,催化效率(K_(cat)/K_(m))分别提高了216%和211%,而最适温度(45℃)和最适pH值(6.0)没有发生变化。K_(cat)/K_(m)的结果显示,在所有的截短菌株中AN菌株的催化效率最低。plaS剪接结果表明,PlaS的ANK结构域至少需要3个ANK repeat才会对PlaA1酶活表现为胞外促进作用,PlaS的C端域对维持PlaA1的结构稳定性起到重要的作用,研究为揭示PlaS对PlaA1的调控机制提供了理论基础。

鸡PLA2基因的克隆与原核表达及PLA2蛋白卵黄抗体的制备

【目的】克隆并原核表达鸡PLA2基因,小量制备鸡PLA2卵黄抗体,为大规模制备PLA2卵黄抗体作为饲料添加剂提供参考。【方法】提取鸡胰脏总RNA,利用RT-PCR方法获得鸡PLA2基因,将其克隆至pGEX-4T-1原核表达载体中,构建表达载体pGEX-4T-1-PLA2,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-PLA2融合蛋白。将GST-PLA2融合蛋白免疫青年蛋鸡,每次0.3mg/只,共免疫4次,收集鸡蛋,提取卵黄抗体,采用West-ern Blotting检测抗体的特异性。【结果】成功克隆出了鸡PLA2基因,构建了pGEX-4T-1-PLA2原核表达载体,并诱导表达了分子质量为44.59ku的GST-PLA2融合蛋白。GST-PLA2融合蛋白免疫蛋鸡后获得了卵黄抗体,经West-ern Blotting检查,制备的卵黄抗体具有很好的特异性。【结论】构建了表达鸡PLA2基因的表达系统,并成功的制备了抗鸡PLA2的卵黄抗体。

婴儿神经轴索营养不良致病基因PLA2G6突变分析

目的探讨婴儿神经轴索营养不良(INAD)PLA2G6基因突变的致病特点,丰富INAD的基因突变谱,为INAD相关遗传咨询提供依据。方法收集1例先证者的家系相关临床资料,采用三人家系全外显子组测序对先证者及其父母进行测序分析,筛选可能的致病突变位点,Sanger测序验证突变位点,结合生物信息学分析对突变位点的致病性进行预测,最后通过羊水穿刺检查为孕妇提供产前诊断。结果全外显子测序结果显示临床表现为精神运动发育倒退的先证者为PLA2G6基因c.1A>G(p.M1?)和c.2242G>A(p.A748T)复合杂合突变,其父亲为c.1A>G(p.M1?)杂合突变携带者,母亲为c.2242G>A(p.A748T)杂合突变携带者。根据美国医学遗传学与基因组学学会变异评级相关指南,c.1A>G(p.M1?)为致病性突变,c.2242G>A(p.A748T)为意义未明突变。产前诊断胎儿为c.1A>G(p.M1?)杂合突变携带者,现该孕妇已足月顺产一男活婴,产后随访7个多月生长状况良好。结论PLA2G6基因c.1A>G(p.M1?)和c.2242G>A(p.A748T)复合杂合突变为该先证者患INAD的遗传病因,其中c.2242G>A(p.A748T)为新发现的变异位点,这扩大了INAD的基因突变图谱,全外显子测序数据为该家系提供了精准的遗传咨询和产前诊断。

磷脂酶A1辅助蛋白N端截短菌株的构建及其优化表达

根据GenBank公布的磷脂酶A1辅助蛋白plaS基因序列,通过生物信息学软件分析,截短辅助蛋白PlaS的N端35AA。将截短后的辅助蛋白plaS基因经PCR扩增技术与原核表达载体pET-28a(+)连接,再转化到BL21(DE3)宿主菌中进行融合表达,从而成功构建dSP28表达菌株。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导辅助蛋白表达,对诱导时间、IPTG浓度、起始菌体浓度(OD_(600nm))和温度逐项进行优化,摸索得到辅助蛋白的最佳诱导表达条件为诱导时间8 h,IPTG浓度0.2 mmol/L,起始体浓度(OD_(600nm))0.7,温度40℃,转速200 r/min。在此条件下,对P28、SP28和dSP28发酵中OD_(600nm)进行测定,结果表明,加入IPTG诱导后P28和dSP28能够快速的增殖,且诱导8 h后仍显示增长趋势,而SP28的生长受到明显的抑制作用。

黏质沙雷氏菌plaA及plaS的生物信息学分析

磷脂酶A1是一类水解磷脂的酶类,利用生物信息学方法对磷脂酶A1基因及辅助蛋白基因进行分析,为进一步研究磷脂酶提供基础。通过对黏质沙雷氏菌plaA(Phospholipase A1)及plaS(accessory protein)进行克隆和测序,对其核苷酸序列和氨基酸序列特征进行分析;对其蛋白质二级结构、三级结构进行了预测;同时运用ML、MP和BI 3种方法构建了系统发育树。结果表明,plaS的dN/dS的值较plaA高,所受的选择压力较小,进化速率较快;Pla A蛋白和Pla S蛋白的二级结构都以α螺旋和无规则卷曲为主;plaA与plaS联合构建的系统发育树支持率较16S单独构建的支持率高。基于plaA、plaS和16S 3个基因联合构建的系统发育树中,解脲沙雷氏菌和嗜线虫沙雷氏菌都与黏质沙雷氏菌聚为一支,在亲缘关系上,这两种沙雷氏菌可能跟黏质沙雷氏菌更为接近。

GPⅢа PLA2、PEAR1、PTGS1基因多态性与阿司匹林临床抗血栓疗效关联性研究

目的:探讨GPⅢаPLA2、PEAR1、PTGS1基因多态性与阿司匹林临床抗血栓疗效的相关性。方法:回顾性筛选我院2015年1月–2016年5月诊断为缺血性疾病并行阿司匹林相关基因检测及血小板聚集率实验室检测的患者信息,共计138例,以花生四烯酸诱导的血小板聚集率数值判断患者服用阿司匹林的疗效,分析影响阿司匹林疗效相关基因多态性。结果:GPⅢаPLA2及PTGS1突变频率较低,PEAR1基因突变频率较高,等位基因频率为63.8%,且突变杂合型频率高于突变纯合型。PEAR1突变纯合型的血小板聚集率显著高于野生型(P=0.007),而突变杂合型与野生型相比未表现出显著性差异(P=0.135)。PEAR1基因突变型(AG和AA)的血小板聚集率显著高于野生型GG(P=0.040),从总体来看,突变位点数目越多,对应的血小板聚集率就越高。结论:PEAR1基因多态性与阿司匹林抗血栓疗效存在相关性,并随着PEAR1的突变基因位点数量增加血小板聚集率也逐渐增加。

宁夏枸杞PLA基因家族cDNA片段的克隆及其生物信息学分析

苯丙氨酸解氨酶（PAL,EC 4.3.1.5）是一种主要的调控酶,在植物体内通过催化L-苯丙氨酸生成肉桂酸来联系初级和次级代谢。本文以宁夏枸杞为材料,利用序列同源原理设计简并引物和RT-PCR技术得到4条PAL基因片段,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该家族的cDNA片段长为1 162~1 183 bp,推导编码554~561个氨基酸,蛋白分子量为60.681~61.250 kD,等电点为7.02~7.71。枸杞PAL基因家族彼此间的氨基酸序列变异度为0.005%~0.336%。氨基酸序列和结构分析显示PAL基因家族有一个保守区域,即屏蔽结构域,以及一个活性位点——苯丙氨酸/组氨酸解氨酶位点。LyPAL1~3蛋白很可能定位在线粒体,而LyPAL4蛋白很可能定位在细胞质。二级结构和三级结构进行预测,发现LyPAL1蛋白中无规则卷曲179个,α螺旋和β折叠分别306和30个,延伸链46个。系统进化分析表明,枸杞LyPAL1~3基因与辣椒的PAL基因具有很高的同源性,而枸杞LyPAL4基因与碧冬茄属的三种植物（Petunia axillaris,Petunia x hybrid,P exserta）具有很高的同源性。这4个基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为KC759153~KC759156。4个LyPAL基因的克隆为进一步研究宁夏枸杞类黄酮等次级代谢物的合成分子机制研究奠定了基础。

婴儿神经轴索营养不良患者PLA2G6基因的突变检测

目的辅助临床确诊1例婴儿神经轴索营养不良(infantile neuroaxonal dystrophy,INAD)家系,为患者家庭遗传咨询和产前诊断提供依据。方法收集患者临床资料,提取先证者及家系成员外周血基因组DNA,PCR扩增INAD致病基因PLA2G6编码序列并进行测序。对发现的突变位点在对照人群中进行验证及相关生物信息学分析。结果先证者表现为进行性智力发育及运动能力落后,头颅MRI显示小脑萎缩。测序结果发现患者PLA2G6基因存在复合性杂合突变,分别为父源性的c.668C>T(p.Pro223Leu)和母源性的c.1534T>A(p.Phe512Ile)突变,且二者在对照人群中未检测到。生物信息学分析显示两种突变均为致病性突变,可引起蛋白质二级结构和氨基酸亲水性改变。结论发现PLA2G6基因的新突变位点c.1534T>A,该突变可与已知致病突变c.668C>T共同导致常染色体隐性遗传病INAD的发生。

北方汉族人PLA2R1基因多态性与脑梗死关系的研究

目的探讨中国北方汉族人群PLA2R1基因多态性与脑梗死的关系。方法选取年龄、性别匹配的中国北方汉族脑梗死患者212人,健康对照组179人,采用PCR技术和限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)的方法检测基因型。结果PLA2R1基因SNP的等位基因和基因型在脑梗死组和对照组的频数分布差异无显著性(P>0.05)。结论中国北方汉族人群中PLA2R1基因多态性与脑梗死的发病可能无关。

PTGS2/PLA2G4A基因多态性与精神分裂症的关系

目的 :在中国北方汉族人群中探讨 PTGS2 / PL A2 G4 A基因多态性与精神分裂症的关系。方法 :采用PCR 技术和限制性内切酶片段长度多态性 (RFL P)的方法 ,检测中国北方汉族 16 8个核心家系的基因型。结果 :PTGS2基因的两个 SNPs(SNP1和 SNP2 )与 PL A2 G4 A基因的一个 SNP(SNP3)的等位基因和基因型在病例组和对照组的频数分布差异无显著性 (P>0 .0 5 )。结论 :在中国北方汉族人群中 PTGS2 / PL A2 G4 A基因多态性与精神分裂症的发病可能无关。

PLA2G4A基因多态性与精神分裂症的关系

目的:探讨1号染色体上PLA2G4A基因多态性与中国北方汉族人群精神分裂症的关系。方法:采用聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法,对235个由精神分裂症患者及其健康父母双亲组成的核心家系进行PLA2G4A基因型检测,应用SPSS12.0统计学软件进行数据管理及数据分析。结果:患者组和父母组中基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05);单倍型相对风险分析(HRR)结果显示,传递和未传递的等位基因A、G的频数分布病例组与对照组比较差异无显著性(P>0.05);传递不平衡检验(TDT)分析结果表明,杂合子父母双亲的两个不同等位基因传递概率未偏离50%(P>0.05)。结论:1号染色体上的PLA2G4A基因可能不是精神分裂症的易感基因。

PLA2G6基因突变致早发型帕金森病2例

PLA2G6基因是常染色体隐性遗传相关的致病基因,临床报道较少。此基因突变可导致iPLA-2β酶不同程度的改变,临床表现为四种不同的临床类型。本文报告两例PLA2G6基因突变导致的青年型帕金森综合征。其中1例患者为PLA2G6基因c.991G>T合并c.1A>G双杂合突变,临床表型为肌张力障碍-帕金森综合征(dystonia-Parkinsonism,DP),多巴胺能药物治疗有效但运动并发症出现较早,肌张力障碍治疗效果欠佳。患者接受了脑深部电刺激手术,术后运动功能较前改善;另1例患者为PLA2G6基因c.991G>T合并c.2752A>G、c.35C>G杂合突变,临床表型为早发型帕金森综合征(early-onset Parkinsonism,EOP)型,左旋多巴治疗效果欠佳。临床分型与杂合突变导致临床异质性有关。基因检测是诊断及鉴别要点。

PLA2G2A基因在胃癌前病变组织中的表达及意义

目的探讨并分析PLA2G2A基因与胃癌前病变组织之间的关系。方法选取2010年6月至2011年6月我院行胃镜检查,确诊为胃癌前病变的患者,同时随机选取53名健康对照,应用RT-PCR方法研究PLA2G2A基因在胃癌前病变组及正常对照组的表达是否存在统计学意义。结果 PLA2G2A基因在癌前病变组织中的表达明显高于正常组织(P<0.01),具有统计学意义。结论 PLA2G2A基因在癌前病变组织中的表达明显高于正常组织,提示PLA2G2A基因在胃癌前病变的发生中可能起到重要的作用,PLA2G2A基因可能成为预测癌前病变,甚至胃癌的重要指标。

PLA2G6基因多态性与偏执型精神分裂症的关联

目的:探讨PLA2G6基因多态性与偏执型精神分裂症的关系。方法:采用聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)方法,在109个偏执型精神分裂症患者核心家系中检测PLA2G6基因上的3个单核苷酸多态性(SNP)(rs2235346、rs2272831和rs2284060)。运用单倍型相对风险(HRR)分析和传递不平衡分析(TDT)方法进行关联分析。结果:所检测的3个SNPs的基因型在患者组和父母组中频数分布均符合Hardy-Weinberg平衡。HRR和TDT分析均表明,rs2272831位点与偏执型精神分裂症相关联(χ2=5.590,υ=1,P=0.018;χ2=5.333,υ=1,P=0.021),而rs2235346和rs2284060位点与偏执型精神分裂症无关联。结论:PLA2G6基因可能是偏执型精神分裂症的易感基因。

水稻类树状突变体pla1-5的鉴定与基因克隆

在粳稻品种台北309经60 Co-γ辐射诱变的后代中发现了一份类树状突变体pla1-5,该突变体表现为植株矮化、叶片小且数量增多、分蘖数减少、高位分蘖、穗分化受阻等特征。遗传分析表明,该性状受一对隐性核基因控制。利用图位克隆技术将目的基因定位在第10染色体长臂上两个分子标记CHR1027和CHR1030之间,物理距离为58kb,并与SSR标记CHR1028和CHR1029共分离。根据水稻基因组序列的注释,该区域内存在5个完整的预测基因。测序分析表明pla1-5突变体中一个编码细胞色素P450CYP78A11的释义基因LOC_Os10g26340第1外显子内缺失了一个碱基T,导致移码突变和翻译提前终止。据此,初步推测细胞色素P450CYP78A11基因为PLA1-5的候选基因。

PLA2G4B基因多态性与精神分裂症的关联性分析

目的:探讨中国北方汉族人群PLA2G4B基因多态性与精神分裂症的遗传关联性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)和连接酶检测反应(LDR)方法,在201个精神分裂症患者核心家系中检测PLA2G4B基因上的错义突变位点rs3816533的单核甘酸多态性,应用遗传统计学方法对研究对象进行单倍型相对风险分析(HRR)和传递不平衡分析(TDT)。结果:PLA2G4B基因rs3816533位点在精神分裂症患者组和父母组中基因型频数分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05);HRR分析结果显示:父母传递和未传递给患病子女的等位基因频数分布差异无显著性(χ2=0.840,P>0.05);TDT分析结果显示:杂合子父母双亲的2个不同等位基因传递概率没有偏离50%(χ2=0.818,P>0.05)。结论:在中国北方汉族人群中PLA2G4B基因rs3816533位点单核甘酸多态性与精神分裂症可能无关联。