“拯救”NA-1株鹅源副黏病毒辅助质粒的构建及鉴定

将本实验室保存的NA-1株鹅源副黏病毒(GPMV)经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液进行病毒纯化,提取病毒基因组RNA。参考GenBank已收录的ZJ1株GPMV基因组序列,设计了4对特异性引物,利用RT-PCR法分别特异性的扩增出病毒NP、P和L基因片段,并将目的基因片段消化、回收纯化,克隆pCI-neo表达载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒选取阳性克隆酶切、PCR鉴定并进行序列测定,结果表明NP、P和L基因正确克隆到pCI-neo表达载体中,并分别命名为pCI-NP、pCI-P和pCI-L。将构建好的pCI-NP、pCI-P和pCI-L重组质粒单独转染Vero细胞,在荧光显微镜下观察到特异绿色荧光,表明NP、P和L蛋白得到成功表达。

复制缺陷型人泡沫病毒载体辅助质粒pΔGP的构建及转染小肠癌细胞的研究

在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHRSV13的基础上,缺失突变gag和pol基因,并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3′LTR,构建辅助质粒pΔGP.将复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP和辅助质粒pΔGP分别转染和共转染小肠癌HIC细胞系,荧光显微镜检测发现共转染pGPSNI EGFP和pΔGP的HIC细胞能够强烈表达绿色荧光蛋白,转染有复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP的HIC细胞能够表达少量的绿色荧光蛋白,而转染有辅助载体pΔGP的HIC细胞不表达绿色荧光.结果证明复制缺陷型人泡沫病毒载体的构建成功,表明人泡沫病毒env基因3′端的内部启动子IP具有弱启动子的活性,并且bel基因产生的调控蛋白能够反式激活人泡沫病毒内部启动子IP和5′LTR的启动子.

新城疫病毒Italien株辅助质粒的构建及功能鉴定

目的构建基于T7启动子的含新城疫病毒(NDV)Italien株核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)和蛋白(L)基因的表达质粒,作为构建重组NDV所需的辅助质粒。方法将NDV的NP、P和L基因酶切后置于T7启动子和核糖体进入位点序列的下游,分别构建NP、P和L基因的表达质粒,转染BSR-T7/5细胞,采用间接免疫荧光法(IFA)检测病毒蛋白的表达,利用微型基因组(MG-L)质粒检测辅助质粒组装核糖核酸蛋白质复合物(RNP)的功能。结果测序证实辅助质粒构建正确。IFA检测可观察到NP和P基因的表达。与MG-L单转染对照组和空白对照组相比,辅助质粒和MG-L共转染后,报告基因萤火虫荧光素酶得到高效表达(P<0.001)。结论成功构建了基于T7启动子的NDV辅助质粒,为进一步构建重组溶瘤NDV Italien株奠定了基础。

拯救新城疫病毒LaSota株辅助质粒的构建

本实验室保存的LaSota株新城疫病毒经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液并纯化病毒,提取病毒基因组RNA。参考GeneBank收录的LaSota株新城疫病毒基因组序列,设计6对特异性引物,分别扩增病毒的NP、P和L1～L4六个基因片段,并将目的片段回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒并酶切鉴定,鉴定正确的样品进行序列测定,并比对测序结果。结果证明测序结果与GeneBank上公布的LaSota株新城疫病毒序列完全一致,没有任何氨基酸和核苷酸的变化,将NP、P、L分别连接至pVAX载体,其中L1～L4为顺次连接。鉴定结果表明NP、P和L基因已正确克隆至pVAX表达载体,证明3个辅助质粒构建成功,分别命名为pVAX-NP、pVAX-P和pVAX-L。

新城疫病毒NP和P基因辅助质粒的构建及鉴定

目的构建新城疫病毒JL02/2000株P和NP基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础。方法根据新城疫病毒(JL02/2000毒株)的全基因组中的NP、P基因分别设计引物,应用RT-PCR方法扩增NP基因和P基因,将扩增的NP基因和P基因片段连接到pMD18-T载体上,限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切鉴定确认后回收目的条带,分别插入到真核表达载体pCI上,经测序确认pCI-NP、pCI-P辅助质粒的构建。将pCI-NP、pCI-P转染BHK-21细胞,两次换液,72h后回收细胞,经RT-PCR检测NP和P基因片段。结果构建的辅助质粒pCI-NP和pCI-P经双酶切和测序鉴定到目的片段。pCI-NP、pCI-P转染后,RT-PCR检测到NP和P基因片段。结论新城疫病毒pCI-NP、pCI-P辅助质粒构建成功,pCI-NP、pCI-P可在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础。

副流感病毒5型CC-14株辅助质粒的构建及鉴定

目的构建副流感病毒5型(parainfluenza virus 5,PIV5)CC-14株核衣壳蛋白(nucleoprotein,NP)、磷蛋白(phosphoprotein,P)和聚合酶蛋白(large protein,L)基因真核表达质粒,并在MDCK细胞中表达,为该病毒反向遗传系统的建立奠定基础。方法根据PIV5 CC-14株全基因组中的NP、P和L基因分别设计特异性引物,经RT-PCR扩增得到NP、P和L基因,酶切后分别连接至pc DNA3.1+真核表达载体(或p MD18-T)上,构建辅助质粒pc DNA3.1-NP、pc DNA3.1-P和pc DNA3.1-L,转染MDCK细胞,RT-PCR检测NP、P和DL基因的转录情况。结果经双酶切及测序鉴定证明辅助质粒pc DNA3.1-NP、pc DNA3.1-P和pc DNA3.1-L构建正确,3个质粒转染MDCK细胞后,经RT-PCR分别可扩增得到NP、P和DL基因片段。结论成功构建了PIV5 CC-14株pc DNA3.1-NP、pc DNA3.1-P和pc DNA3.1-L辅助质粒,且均可在MDCK细胞中有效转录,为该病毒反向遗传系统的建立奠定了基础。

新城疫病毒基因Ⅶ型辅助质粒的构建

目的:利用反向遗传操作技术,构建新城疫病毒基因ⅦNP、P和L3个辅助质粒,为新城疫病毒基因Ⅶ反向遗传的拯救提供基础。方法:提取尿囊液病毒RNA,利用RT-PCR技术,分别扩增NP、P和L片段,并连接至克隆载体,通过电泳、酶切验证以及测序后连接至辅助质粒载体pCI-neo。结果成功获取NP、P和L3个目的基因,测序结果与预期一致;成功构建pCI-NP、pCI-P和pCI-L3个辅助质粒。结论:本文成功构建的3条辅助质粒为后期NDVⅦ反向遗传的构建提供基础。

新城疫病毒Clone 30株辅助表达系统的构建及真核表达

为研究新城疫病毒NP、P和L蛋白作用机理和新城疫病毒反向遗传操作系统,构建新城疫病毒Clone 30株NP、P和L基因的真核表达载体。根据Gen Bank中新城疫病毒Clone 30株的全长序列(Y18898.1),设计3对特异性引物,用RT-PCR法扩增出新城疫病毒Clone 30株的NP、P和L基因,将其克隆到真核载体pCI-neo上。通过酶切和测序验证克隆正确,得到重组质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L,瞬时转染到BHK-21细胞中。经RT-PCR、Western blot、间接免疫荧光试验分别检测NP、P和L蛋白在BHK-21细胞中的表达。结果表明,重组质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L构建成功,为后期新城疫病毒反向遗传操作系统的构建奠定了基础。

家蚕转基因技术中若干因素对转基因效率的影响

建立高效、稳定的家蚕Bombyx mori转基因技术对于推进家蚕功能基因组研究,解决蚕丝产业重大问题以及向非绢丝产业拓展等具有重要意义。本文在已建立的基于piggyBac的家蚕转基因技术基础上,探索了多个影响转基因效率的因素。结果显示:以家蚕品种大造(P50)为供试材料、pBac[GOI]为供体质粒、pHA4PIG为辅助质粒,以眼睛和神经组织特异启动子3×p3启动的红色荧光蛋白基因DsRed为报告基因,在蚕卵产下后2～3h进行注射,综合效果最佳,孵化率和转化率分别达到62.7%和34.8%;荧光筛选的最佳时期在胚胎发育第5到第8天;在2000～8000bp之间时,外源片段的长度对转化率并无太大影响。本研究建立的技术体系,有望为家蚕功能基因研究、品种分子改良和家蚕生物反应器的开发奠定基础,并为其他鳞翅目昆虫转基因技术的建立提供参考。

传染性造血器官坏死病毒微型基因组表达干扰素对病毒的抑制效应

为构建传染性造血器官坏死病毒(IHNV HLJ-09)微型基因组并表达虹鳟IFN,采用RT-PCR扩增IHNV HLJ-09株的N、P、L、G和NV蛋白基因并亚克隆入真核表达载体pCI中,构建辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV;将扩增获得的IHNV基因组两末端序列、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因、虹鳟I型干扰素(IFN)基因克隆到真核表达载体pCI中构建出表达EGFP的IHNV微型基因组pCI-LFGT和表达IFN的IHNV微型基因组pCI-LFIT;将pCI-LFIT质粒转染已接种IHNV HLJ-09毒株的EPC细胞,实时荧光定量PCR法测定细胞中IHNV G基因RNA。结果显示:构建的微型基因组不论与辅助病毒还是与5个辅助质粒共转染,外源基因均能正确表达;pCI-LFIT质粒转染已接种病毒的EPC细胞组与对照组相比其中的病毒核酸显著减少。

新城疫病毒La Sota株NP、P和L基因表达载体的构建及真核表达

为研究新城疫病毒NP、P和L蛋白作用机理和新城疫病毒反向遗传操作系统,构建新城疫病毒La Sota株NP、P和L基因的真核表达载体。根据GenBank中新城疫La Sota株的全长序列(JF950510.1),设计4对特异性引物,用RT-PCR法扩增出新城疫病毒La Sota株的NP、P和L基因,将其克隆到真核载体pCl-neo上。通过酶切和测序验证克隆正确,得到重组质粒pCl-NP、pCl-P和pCl-L,瞬时转染到BHK-21细胞中。经RT-PCR、Western blot、间接免疫荧光试验分别检测NP、P和L蛋白在BHK-21细胞中的表达。经上述三种方法分别检测到NP、P和L蛋白在BHK-21细胞中的表达。重组质粒pCl-NP、pCl-P和pCl-L构建成功,为后期新城疫病毒反向遗传操作系统的构建奠定了基础。

多变鱼腥藻ATCC 29413基因的一步插入失活

多变鱼腥藻ATCC 29413有潜力发展为异养生长产异形胞蓝藻的研究模式种,但由于细胞内的限制-修饰系统等原因,其基因转移效率极低。研究克隆了该藻株的两个甲基化酶(M.AvaⅠ和M.AvrⅡ)基因ava_3181和ava_4359,构建了辅助质粒pHB6088,对运载质粒进行甲基化保护以避免被细胞中的限制酶切割。以ava_1237和ava_4412基因为例,研究证明利用该辅助质粒和接合转移系统可通过双交换对多变鱼腥藻ATCC 29413的基因实现一步插入失活。

ClassⅠ新城疫病毒BJ1株微基因组的构建及功能鉴定

将以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的ClassⅠ类新城疫病毒(NDV)BJ1株微基因组质粒pOK-M和3个辅助蛋白表达质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L共转染BSR T7/5细胞,转染24 h即可见到明显的绿色荧光,表明微基因组及其3种辅助质粒均获得了表达,并具有各自的生物学功能,为进一步建立该毒株的反向遗传操作系统奠定了基础。

抗体库技术中辅助噬菌体的研究进展

噬菌体抗体库作为噬菌体展示和抗体库2种技术的集合体，可以，奈需经过免疫而直接获取各种人源抗体，目前已广泛应用于生物学及医学等领域。在通常使用的噬菌粒系统中，使用野生型辅助噬菌体会导致“噬菌体污染”，使得仅有很少部分子代噬菌体带有抗体片段，这对抗体库的筛选工作非常不利。近年来，研究人员通过对噬菌体衣壳蛋白基因（g3）部分缺失、引入琥珀突变、构建新型辅助噬菌体或辅助质粒等策略，不仅有效避免了辅助噬菌体污染问题，使抗体展示效率提高了5～20倍，进而通过增加单价抗体展示在每个噬菌体表面，使抗原结合能力提高400倍，并且在第二轮筛选中即可得到有效富集（阳性克隆率超过50％）。本文综述了近年来应用在噬菌体抗体库的一些新型的辅助感染系统。