多酶级联反应催化γ-丁内酯生成1,4-丁二醇

1,4-丁二醇是一种重要的化学品中间体,已被列入NICNAS高价值量工业化学品清单(HVICL).随着1,4-丁二醇的全球市场需求量不断增加,利用微生物法合成1,4-丁二醇已成为关注热点.基于多酶级联催化构建了一条以γ-丁内酯为底物合成1,4-丁二醇的路径,首先通过己内酯水解酶(ChnC)将γ-丁内酯水解为4-羟基丁酸,接着在羧酸还原酶(Car)的作用下,将4-羟基丁酸还原成4-羟基丁醛,随后,利用醇脱氢酶(YqhD)将4-羟基丁醛进一步还原生成1,4-丁二醇;同时通过引入了甲酸脱氢酶(FDH)构建了NADH/NAD+辅酶循环再生系统.最后对底物添加浓度、催化温度、pH和多酶添加比例进行了优化.综合3种酶的最适反应条件优化之后,在30℃、pH 7.0、酶活力添加比例为1:3:2的优化条件下,以5 g/Lγ-丁内酯为底物,1,4-丁二醇产量达到2.41 g/L,摩尔转化率为46.1%,与优化前相比分别提高了375.46%和374.79%.最后,通过底物补加试验,1,4-丁二醇的合成量最高达到6.31 g/L,摩尔转化率最高达到67.3%.本研究基于新设计的1,4-丁二醇多酶级联催化路径,实现了1,4-丁二醇酶法合成,结果有望为酶催化合成1,4-丁二醇及其高附加值衍生的产品提供一种新的思路.(图12表2参41)

分子改造甲烷八叠球菌醇脱氢酶催化合成4-羟基-2-丁酮

4-羟基-2-丁酮(4H2B)是一种重要的药物中间体,可以用于合成抗HIV药物度鲁特韦重要手性中间体(R)-3-氨基丁醇,但4H2B价格昂贵,本研究旨在通过酶催化反应,将廉价的1,3-丁二醇(1,3-BDO)催化合成4H2B,以便用于后续开发合成4H2B的衍生物.首先克隆表征了一种甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)来源的醇脱氢酶(MeADH),研究发现,其可用于催化1,3-BDO合成4H2B.MeADH最适催化温度为60℃,最适催化pH为10.0.经酶学性质分析发现,MeADH在最适反应温度60℃下孵育48 h仅剩7.51%左右残余酶活力,说明其热稳定性不佳.基于计算机辅助设计选择了15个突变位点,筛选得到一个双突变MeADHE246P/T296P,在60℃条件下孵育48 h,其残余酶活为初始酶活的40.27%左右,比原始酶提高了5.36倍.此外,MeADH催化反应过程中需要辅酶NADP^(+),通过引入鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)来源的NADH氧化酶(LrNox)突变体LrNoxL179S构建了NADP^(+)辅酶循环体系,并将其应用到4H2B的生物合成中.本研究通过优化反应条件和底物流加实验,4H2B合成量最高达到2.2 g/L左右,为后续进行高效生物合成4-羟基-2-丁酮及其衍生物的研究奠定了基础.(图10表3参29)