依赖辅酶B12的甘油脱水酶生物信息学分析

用生物信息学的方法对依赖辅酶B_(12)型甘油脱水酶的各个亚基结构进行了分析,并对其功能进行了探讨。通过对底物未结合时与底物结合后的酶分子构象变化进行分析,探讨了底物的结合对各个亚基的影响。

宏基因组中不依赖辅酶B12甘油脱水酶基因的筛选和表达

通过特定的引物,以土壤宏基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得3.3 kb的DNA片段,该片段连接于pSE380载体构建重组质粒pSE380-dhaB12用于测序和表达。序列分析表明,该DNA片段编码的氨基酸序列与已报导的丁酸梭菌不依赖辅酶B12甘油脱水酶的相似性达99%。通过IPTG诱导,dhaB12基因在大肠杆菌中表达成功,SDS-PAGE分析表明有88 kD和34 kD两条蛋白质条带,在没有辅酶B12存在的情况下,所表达的酶具有明显的甘油脱水酶活性。

重组依赖辅酶B12的甘油脱水酶基因表达系统构建

采用PCR方法从肺炎克雷伯氏杆菌基因组中分别扩增得到了编码依赖辅酶B12的甘油脱水酶α、β、γ三个亚基的基因gldA、gldB、gld将gldBC基因克隆至pSIM—T载体上，经测序正确后亚克隆至pGEX-4T-1载体中。将gldA进行T-A克隆后测定核苷酸序列正确，亚克隆至连有gldBC基因的pGEX-4T-1载体中。从而成功的构建了gldABC基因的同向串联原核融合表达载体pGEX—gldABC。

脉冲光声量热法测定辅酶B12Co-C键断裂的焓变和反应体积变化

本文用光声量热法（ＰＡＣ）研究了辅酶Ｂ１２的光解反应，同时测定了脉冲激光诱发的辅酶Ｂ１２光解反应的焓变和反应体积变化，它们的数值分别为３１±２ｋｃａｌｍｏｌ＾－１和７±１ｍｌｍｏｌ＾－１估算出Ｃｏ－Ｃ键离解能，并推测反应体积变化可能与Ｃｏ－Ｃ键断裂引起的柔性咕啉环构象变化有关。

辅酶B_(12)模型化合物的研究——Ⅰ.双水杨醛缩乙二亚胺烷基钴(Ⅲ)配合物Co-C键的性质

本工作合成、表征了一系列辅酶B_(12)模型化合物RCo(Salen)L,其中R=CH_3,C_2H_5,n和i-C_3H_7,n和i-C_4H_9,研究了上述配合物固体和溶液的Co-C键稳定性,结果表明:固体配合物Co-C键断裂的温度受烷基位阻影响,它们具有以下顺序:CH_3>C_2H_5>n-C_3H_7≈n-C_4H_9≈i-C_4H_9≈i-C_3H_7.此外还确定了影响配合物Co-C键在溶液中稳定性的因素.

辅酶B_（12）模型化合物的研究（Ⅵ）──轴向及平面配体对RCo（salen）L和RCo（SB）L中Co─C键稳定性的影响

合成与表征了两类１４种烷基钴Ｓｃｈｉｆｆ碱配合物ＲＣｏ（ｃｈｅｌ）Ｌ（Ｒ＝ＣＨ_３，Ｃ_２Ｈ_５，ｎ－Ｃ_３Ｈ_７，ｎ－Ｃ_４Ｈ_９，ｉ－Ｃ_４Ｈ_９；ｃｈｅｌ＝ｓａｌｅｎ，ＳＢ；Ｌ＝Ｐｙ，γ－ｐｉｃ，ＰＰｈ_３），其中ＲＣｏ（ＳＢ）Ｌ是一类新的辅酶Ｂ_（１２）模型化合物，五配位的Ｃ_２Ｈ_５Ｃｏ（ＳＢ）也是首次报道．研究了在固态和溶液中配合物的性质，并讨论了影响配合物中Ｃｏ─Ｃ键稳定性的因素．

电化学及光谱电化学方法研究辅酶B_(12)模型化合物的生成与解离.Ⅰ.

本文用电化学及光谱电化学方法研究了钴卟啉与苄基氯的相互作用,表明形成有σ钴—碳键的辅酶B_(12)模型化合物的前提条件是钴卟啉的中心钴氧化态必须降低到I价.讨论了σ钴—碳键的形成和解离与电位的关系,现场检测到辅酶B_(12)模型化合物的形成和解离的紫外可见光谱,提出了钴卟啉与苄基氯的ECE作用机理.

辅酶B_(12)模型化合物的研究(Ⅲ)——一类新型烷基钴Schiff碱配合物的合成及Co—C键稳定性

合成与表征了一系列烷基钻Schiff碱配合物RCo(SB)L(R为甲,乙,丙,正丁和异丁基;L为水;SB为双水杨醛缩二甲基丁二胺),它们是一类尚未见报道的新的辅酶B_(12)模型化合物。该配合物的溶液很不稳定,加热或光照促使Co—C键断裂,轴向烷基和平伏面配体对Co—C键稳定性均有影响。经紫外、可见分光光度法及自旋捕集ESR法确定了热分解和光分解反应的产物和超精细分裂常数。

薄层光谱电化学法测定辅酶B_(12)模型化合物的生成速率常数

用薄层光谱电化学方法和单电位-计时吸收光谱法(SPS-CA),测得钴四苯基卟啉(CoTPP)分别与碘甲烷、苄基氯和氯丁烷形成含σ钴-碳键辅酶B_(12)模型化合物的速率常数为11.09、1.62×10~2和6.93×10^(-2)mol^(-1)·L·s^(-1)。钴卟啉与这3种卤代烷的反应是二级反应,对各自的反应物Co(Ⅰ)TPP和卤代烷都是一级反应。

辅酶B_（12）模型化合物的研究（Ⅷ）──RCo（Salen）L配合物Co－C键氧插入光化学反应产物的表征

辅酶Ｂ_（１２）模型化合物的研究（Ⅷ）──ＲＣｏ（Ｓａｌｅｎ）Ｌ配合物Ｃｏ－Ｃ键氧插入光化学反应产物的表征王志林，易争平，李田，陈瑛，黄志明，杨桂娣，薛德平，陈慧兰（南京大学化学系配位化学国家重点实验室南京，２１００９３）关键词烷基钴Ｓｃｈｉｆｆ碱配?..

辅酶B_(12)模型化合物的研究(V)RCo(Salen)L配合物Co—C键断裂的动力学

运用光度法研究了RCo(Salen)L配合物在甲醇中热分解反应动力学;测定了Co—C键断裂的速率常数及活化能,得到表观速率常数顺序为i-C3H7>i-C4H9>n-C4H9>n-C3H7>C2H5,活化能顺序为i-C3H7<n-C4H9<i-C4H9≈n-C3H7<C2H5,讨论了影响速率常数和温度的因素。

辅酶B_(12)模型化合物的研究 α.RCo(salen) L(R=n-C_3H_7,i-C_4H_9;L=H_2O,py,γ-pic)的电化学性质

用循环伏安法研究了辅酶 B1 2 模型化合物 RCo(salen) L (R=n- C3 H7,i- C4H9;L=H2 O,py,γ-pic)的电化学行为 ,讨论了轴向碱基 L对氧化还原电位的影响。结果表明 :随着碱基 L给电子能力的增强 ,其氧化还原电位均发生负移。

辅酶B_（12）Costa型模型化合物的合成与表征

合成了以Ｎ，Ｎ′一双（２，３－丁二酮－２－亚胺－３－肟）丙二胺为平面配体的烷基钴Ｓｃｈｉｆ碱－肟类辅酶Ｂ１２Ｃｏｓｔａ型模型化合物［ＲＣｏ（ＤＯ）（ＤＯＨ）ｐｎ·Ｈ２Ｏ］，其中，Ｒ＝ｎＣ３Ｈ７；ｎ－Ｃ４Ｈ７；ｉＣ４Ｈ９；ｎＣ５Ｈ１１；Ｃ－Ｃ６Ｈ１１；Ｃ６Ｈ５ＣＨ２，用紫外可见光谱、红外光谱、元素分析和ＨＮＭＲ进行了表征，讨论了不同Ｒ基加入对配合物的影响，为探讨辅酶Ｂ１２诱导的重排反应机理。

辅酶B_(12)模型化合物生成与解离电化学研究(Ⅱ)

用电化学方法研究了钴卟啉与多种直键溴代烷的相互作用，表明Ⅰ价钴卟啉可以与溴代烷形成有σ钴-碳键的输酶B12模型化合物．计算了Ⅰ价钴卟啉与各种直键溴代烷的加合速率常数．详细讨论了直键烷烃的链长与模型化合物生成速率及烷基钴卟啉负离子稳定性的关系．讨论了几种模型化合物的优劣．

碱退式辅酶B_(12)类似物的合成和光谱性质

本工作用改进的方法合成了一类新的辅酶Ｂ１２碱退式类似物－含２＇－脱氧核苷啉醇酰胺。它们分别是２＇，５＇－二脱氧尿苷钴啉醇酰胺－二脱氧腺苷钴啉醇酰胺（２＇ｄＡｄｏＣｂｉ），２＇５＇－二脱氧胞苷钴啉醇酰胺（２＇ｄＣｙｔＣｂｉ）以及５＇－脱氧胞苷钴啉醇酰胺。研究了它们的ＵＶ－Ｖｉｓ和＾１ＨＮＭＲ光谱性质，并且和相应钴胺素的有关性质作了比较。

辅酶B_(12)模型化合物研究 Ⅹ.Costa型模型化合物的合成、表征及电化学性质研究

合成了以 N,N′-双 (2 ,3-丁二酮 - 2 -亚胺 - 3-肟 )丙二胺为平面配体的烷基钴 Schiff碱一肟类 (Costa型 )模型化合物 [RCo(DO) (DOH) pn(H2 O) ] X,(R=n- C3 H7,n- C4H9,i- C4H9,n-C5H1 1 ,c- C6H1 1 ,CH2 C6H5.X=Cl O4-,PF-6)。用元素分析、紫外可见光谱和 1 H NMR进行了表征 ,并用循环伏安法研究了 [RCo(DO) (DOH) pn.H2 O] .Cl O4(R为上述六种烷基 )化合物的电化学性质 ,表明随烷基 R推电子能力增强 ,其氧化还原电位变负。

烷基钴肟辅酶B_(12)模型化合物的合成及表征

目的 研究钴肟类辅酶B12 模型化合物的合成。方法 用还原性烷基化方法合成烷基钴肟类辅酶B12 模型。结果 合成了一系列烷基钴肟模型物RCo (DMG) 2 ·L (R =i-C4 H9、n -C4 H9、n -C5H11、c -C6 H11、、Ph CH2 ,DMG =丁二酮肟 ,L =H2 O)。结论 产物用紫外可见光谱、一维核磁共振谱 (1HNMR)进行了表征 。

β-环糊精与辅酶B_(12)模型物超分子化合物的合成与表征

目的 研究 β 环糊精与烷基钴肟类辅酶B12 模型物超分子化合物的合成。方法 烷基钴肟类辅酶B12 模型物通过还原性烷基化作用方法合成 ,所得产物与 β 环糊精在 50℃水溶液中溶解、过滤 ,滤液在2 5℃下静置 (避光 ) ,1周后得红棕色晶体。结果 产品用元素分析、紫外可见光谱表征 ,并利用低温四圆衍射仪进行了晶体结构分析 ,证实了烷基钴肟与 β 环糊精超分子化合物的形成。 结论 β 环糊精与烷基钴肟形成 1∶1包合物 ,其中 ,烷基钴肟的烷基包结在β 环糊精的疏水腔内 ,平面配体位于 β 环糊精的较大开口端。

烷基钴肟辅酶B_(12)模型化合物的电化学性质研究

目的 研究钴肟类辅酶B12 模型化合物的电化学性质。方法 用循环伏安法研究了钴肟类模型化合物RCo(DMG) 2 ·L(R =n -C3 H7、i-C4 H9、n -C4 H9、n -C5H11、c -C6H11、PhCH2 、Cl,DMG =丁二酮肟 ,L =H2 O)的电化学性质。结果 RCo (DMG) 2 ·L的循环伏安图表明 ,其氧化还原过程伴随两个准可逆氧化还原反应 (1)和 (2 ) ,并伴随Co -C键的断裂 ,且随R的推电子能力增强 ,其氧化还原电位变负。结论 钴肟类化合物是适宜的辅酶B12 模型。

光声量热法测定辅酶B_(12)的光解量子产率

A photoacoustic detection system consisted of a piezoelectric cylindrical tube trans-ducer is applied to measure the photolysis of Coenzyme B12 (5’-deoxyadenosylcobalamin, AdoCbl)in methanol to obtain the quantum yield, φ. The value of 0.20±0.05 is in agreement with that obtained in aqueous solution by other authors with an optical method.