相同遗传背景不同辐射抗拒鼻咽癌细胞miRNA差异表达的研究

目的:在验证相同遗传背景鼻咽癌(NPC)细胞CNE-2R和CNE-2不同辐射抗拒性的基础上,探索微小RNA(miRNA)在CNE-2R和CNE-2中的表达差异与肿瘤辐射抗拒的关系。方法:通过观察X线照射对CNE-2R和CNE-2细胞克隆形成数目的影响,利用SigmaPlot软件进行分析及线性二次模型拟合存活曲线,比较CNE-2R和CNE-2细胞剂量存活曲线及其生物学参数;采用μParafloTM微流体芯片检测,用激光扫描仪(GenePix4000B,Molecular Device)采集杂交图像,经LOWESS滤器规范信号后分析数据差异,根据Targetscan311数据库资料(http://www.targetscan.org),预测CNE-2R和CNE-2细胞miRNA差异表达与NPC不同辐射抗拒的关系。结果:发现在CNE-2R和CNE-2细胞中存在miRNA的差异表达,即与CNE-2细胞比,在检测到的719个miRNA中,CNE-2R细胞中有37个上调,29个下调,其中检测量的绝对值≥2000且两者相差≥2倍的miRNA共12个:hsa-miR-200b、hsa-miR-224、hsa-miR-26b、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-205、hsa-let-7e、hsa-let-7g、hsa-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-103、hsa-miR-106b和hsa-miR-93。分析结果表明显著差异表达的miRNA与辐射抗拒密切相关。结论:相同遗传背景不同辐射抗拒NPC细胞株CNE-2R和CNE-2细胞的miRNA表达存在差异;差异表达的miRNA与辐射抗拒相关。

不同辐射抗拒鼻咽癌细胞细胞周期和形态学差异比较

【目的】探索不同辐射抗拒鼻咽癌细胞CNE-2R和CNE-2细胞周期和形态学差异。【方法】细胞流式术检测细胞株CNE-2R和CNE-2在同步化前、同步化后及去同步化后24 h的细胞周期分布;透射电子显微镜观察CNE-2R和CNE-2形态学差异。【结果】撤去血清(细胞同步化)后24 h,CNE-2R和CNE-2中分别52.9%和52.1%细胞停滞于G0/G1期;加入血清(去同步化)24 h后发现,CNE-2细胞周期中G1期细胞下降到48.5%,而G2期细胞有所上升,但CNE-2R细胞中G1期细胞与同步化前相比反而增加(65.3%)。与CNE-2细胞(26.5%)相比,CNE-2R处于G2期的细胞比例(8.4%)则明显减少;CNE-2R细胞S期的比例(26.3%)与CNE-2细胞(25.1%)相仿;与CNE-2细胞相比,CNE-2R线粒体数量增多、体积增大、嵴清晰;内质网扩张,呈现板层状态;可见CNE-2R细胞内微腔的形成。【结论】鼻咽癌细胞的不同辐射抗拒机制与细胞周期分布和细胞器的形态学改变有关。

新型单羰基姜黄素衍生物B06对不同辐射抗拒鼻咽癌细胞的抑制作用

目的研究姜黄素及其单羰基结构衍生物B06对不同辐射抗拒鼻咽癌细胞株CNE-2与CNE-2R的作用。方法以MTT法检测姜黄素和B06对细胞增殖的影响,以流式细胞仪检测姜黄素和B06对细胞凋亡的影响,以Western-blot检测姜黄素和B06对ERS通路相关蛋白的影响。结果姜黄素对CNE-2和CNE-2R的IC50分别为8.35μM和6.84μM,B06对CNE-2和CNE-2R的IC50分别为1.09μM和0.74μM。B06能激活CNE-2R细胞ERS通路中关键蛋白CHOP、XBP-1、ATF-4的表达,而姜黄素则不能激活其表达。结论新型单羰基姜黄素衍生物B06能更显著地抑制辐射抗拒鼻咽癌细胞的增殖,该作用机制很可能是通过ERS通路发挥,提示B06具有抑制辐射抗拒鼻咽癌细胞的潜在价值。

相同遗传背景鼻咽癌细胞株辐射抗拒与STR基因座相关性的研究

目的在验证鼻咽癌细胞CNE-2和CNE-2R不同辐射抗拒性的基础上,探索STR基因座在CNE-2和CNE-2R中的表达差异。方法快速Chelex-100法提取CNE-2和CNE-2R细胞株的DNA,利用Pow-erPlex(16体系荧光标记的多重聚合酶链反应(PCR)系统对15个常染色体STR基因座(D3S1358,TH01,D18S51,PentaE,D5S818,D13S317,D7S820,D16S539,CSF1PO,Penta D,Vwa,D8S1179,TPOX和FGA)和性别基因(Amelogenin)进行扩增,并在ABI3100型遗传分析仪上对PCR扩增产物进行电泳分析,最后用GeneMapper(3.0软件对等位基因进行自动分型。结果本研究发现在检测的15个STR基因座和性别基因Amelogenin中,CNE-2和CNE-2R细胞STR基因座的表达存在差异,即与CNE-2细胞相比,CNE-2R细胞D8S1179,D13S317和TH01 3个基因座的表达存在显著差异,其中D8S1179基因座存在等位基因的缺失;而D13S317和TH01 2个基因座等位基因间的峰高比值和峰面积比值存在显著差异。结论不同辐射抗拒鼻咽癌细胞株CNE-2和CNE-2R细胞的STR基因座表达存在量和质的差异,提示变异的STR基因座可能参与鼻咽癌细胞CNE-2辐射抗拒的诱导。

同源不同辐射抗拒NPC细胞间总甲基化水平及基因甲基化表达差异的探讨

目的:比较同源不同辐射抗拒能力的鼻咽癌细胞CNE2R/CNE2间总甲基化水平及其区域的差异。方法:采用赵存友博士改良的基于甲基化敏感酶全基因组甲基化法检测CNE2R/CNE2细胞全基因组甲基化水平;同时采用Me DIP-Seq测序法对CNE2R/CNE2细胞进行测序,分析比较DNA甲基化区域(主要包括6个基因功能元件即CDS、intron、downstream2k、upstream2k、3’UTR及5’UTR)的差异。结果:CNE2R细胞全基因组甲基化水平比CNE2细胞低约30%;在CNE2R和CNE2细胞中,虽然分布在6个基因功能元件上的峰值个数和峰值在各基因元件上的覆盖度均无明显差异,但2种细胞的6个基因功能元件上基因甲基化存在差异。结论:同源不同辐射抗拒能力的鼻咽癌细胞间总甲基化水平及基因甲基化存在差异,推测DNA甲基化的差异可能与鼻咽癌辐射抗拒相关。

姜黄素衍生物B50对不同辐射抗拒的同源鼻咽癌细胞增殖及凋亡的作用

目的:比较姜黄素衍生物(B50)抑制不同辐射抗拒的同源鼻咽癌细胞CNE-2与CNE-2R作用的差异。方法:采用MTT法和克隆形成实验检测B50对细胞活力及增殖的影响,以流式细胞仪检测B50对细胞周期分布、细胞凋亡及线粒体膜电位的影响。结果:B50可抑制CNE-2R细胞的活力[24 h、48 h、72 h的IC50分别为(8.06±0.14)、(2.49±0.02)、(1.42±0.02)μmol/L],且呈时间浓度依赖性,其抑制作用明显优于对CNE-2细胞的作用[24 h、48 h、72 h的IC50分别为(8.18±0.12)μmol/L、(3.00±0.04)μmol/L、(1.75±0.01)μmol/L],P<0.01;同时B50抑制CNE-2R细胞增殖的作用明显优于对CNE-2的作用[48 h的IC50分别为(0.55±0.01)μmol/Lvs(0.82±0.01)μmol/L],P<0.01;药物作用48 h后,B50使CNE-2R细胞G2/M期的比例升高(7.1%→34.9%),明显优于CNE-2细胞(12.4%→35.7%)(P<0.01);B50作用于CNE-2R细胞24 h后早期凋亡率升高(3.7%→19.5%),明显优于CNE-2细胞(4.4%→14.8%)(P<0.01);B50作用24 h后,CNE-2R细胞线粒体膜电位下降了(43.17±3.11)%,明显优于对CNE-2细胞的降低率[(35.06±1.07)%](P<0.01)。结论:与CNE-2相比,B50能更显著地抑制辐射抗拒CNE-2R细胞的细胞活力及增殖能力,且更明显地调控细胞周期停滞于G2/M期,诱导细胞凋亡及降低线粒体膜电位。这些结果提示B50具有逆转辐射抗拒的潜在价值。

阿司匹林对同源不同辐射抗拒能力鼻咽癌细胞的凋亡诱导作用

目的:探讨阿司匹林诱导同源不同辐射抗拒能力鼻咽癌细胞株CNE2R/CNE2凋亡的作用及其机制。方法:采用MTT法、流式细胞术和Western blot法检测并比较阿司匹林对CNE2R和CNE2细胞活力、细胞凋亡及凋亡相关蛋白procaspase-3、cleaved caspase-3、procaspase-9、procaspase-12、PARP、cleaved PARP、Bcl-2和Bax,以及PI3K p110α、Akt和p27蛋白水平的影响。结果:阿司匹林抑制同源不同辐射抗拒能力细胞CNE2R/CNE2的活力(阿司匹林对CNE2细胞作用24、48和72 h的IC50分别为6.18、3.92和3.06 mmol/L,对CNE2R细胞作用24、48和72 h的IC50分别为7.05、3.90和2.20 mmol/L,两者差异无统计学显著性)。阿司匹林作用48 h后,CNE2R细胞凋亡率升高,明显高于CNE2细胞(P<0.05)。阿司匹林作用48 h后,CNE2和CNE2R细胞中procaspase-3、procaspase-9、procaspase-12和PARP的蛋白水平降低,cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平升高(P<0.05);PI3K p110α和Akt蛋白水平下降,Bcl-2水平降低,Bax水平升高,Bcl-2/Bax比值降低,p27水平升高(P<0.05)。结论:阿司匹林对同源不同辐射抗拒能力鼻咽癌细胞株CNE2R和CNE2具有同等细胞活力抑制作用;并且可以诱导细胞凋亡,且对抗辐射细胞株CNE2R的凋亡诱导作用更明显。阿司匹林的抗癌作用可能与其影响PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白的水平有关。

辐射抗性食管癌细胞亚系TE-1R的建立及其辐射抗拒机制的研究

目的建立辐射抗性食管癌细胞亚系TE-1R，并探讨其辐射诱导的凋亡性及辐射抗性机制。方法采用分次、间歇照射的方法（2Gy，5次）诱导人食管癌细胞系TE-1产生具有稳定辐射抗性的细胞亚系TE-1R，显微镜下观察细胞形态学差异。以TE-1和TE-1R细胞为实验对象，给予6MVX射线单次照射（2Gy），流式细胞仪分析细胞照射后的凋亡情况，RT—PCR法和Western Blot法分别检测食管癌TE-1、TE-1R细胞中复制蛋白AI（RPA1）mRNA和蛋白的表达情况。结果筛选出辐射抗性食管癌细胞亚系TE—1R。2Gy射线照射后12、24和48hTE-1R细胞的凋亡率低于TE—1细胞（P〈0．05）。RPA1 mRNA和蛋白在TE—1R细胞中的表达高于TE-1细胞（P〈0．05）。结论成功建立了辐射抗性的食管癌细胞亚系TE-1R，新的细胞亚系TE-1R比其亲本细胞系TE-1对射线更加抗拒，RPA1可能在食管癌细胞辐射抗性的修复中起着重要作用。

辐射致鼻咽癌细胞株cdkl和survivin表达与细胞增殖时相转换的关系

目的：探讨鼻咽癌细胞放疗后肿瘤细胞加速衰老及辐射抗拒机制。方法：采用免疫印迹，流式细胞术，sA-β-gal及H-E染色，BrdU细胞标记及细胞计数的方法，检测鼻咽癌CNE2细胞株5Gy间断照射后，细胞周期时相与cdc2／cdkl和survivin蛋白表达的关系。结果：鼻咽癌细胞株射线5Gy间断照射期间及照射后的2～6d内，细胞BrdU标记率大于90％，SA-β-gal阳性细胞小于3％，流式显示G2／M期细胞比例增多，cdkl和survivin表达无明显变化，PCNA表达稍有增加，此期即加速增殖期；细胞处理后第7天～25天，流式显示G1／S期细胞比例增多，BrdU标记率小于10％，SA-β-gal染色阳性细胞达55％以上，H-E染色可见四倍体细胞，cdkl和survivin表达明显下降，PCNA下调不明显，此期即细胞增殖阻滞期；照射细胞后第26天以后，细胞BrdU标记率恢复大于90％，sA-β-gal阳性细胞小于3％，流式检测G2／M期细胞比例增多，cdkl和survivin表达明显上调，此期即再增殖期，结论：细胞衰老可能是人鼻咽癌细胞放射后的反应，衰老细胞中cdkl和survivin表达上调可能是鼻咽癌衰老细胞再增殖机制，也可能是鼻咽癌局部复发和进展的根源。

基于iTRAQ定量蛋白质组学方法筛选鼻咽癌放射抗拒相关蛋白

目的比较不同放射敏感性鼻咽癌患者血清蛋白质表达差异,筛选出与鼻咽癌放射抗拒性相关的蛋白质。方法提取不同放射敏感性鼻咽癌患者血清蛋白,应用核素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术标记蛋白,联合液相色谱和串联质谱(LC-MS/MS)分离、分析肽段。采用Proteome Discoverer 1.4软件对蛋白进行鉴定和定量分析,对获得的差异蛋白进行GO分析。结果共鉴定出差异表达的蛋白质65个,其中上调34个、下调31个,GO分析显示差异表达的蛋白质主要涉及生物学过程调控、压力应激反应及分解代谢等生物学过程。结论 S100A7、胰岛素样生长因子结合蛋白2、α1抗胰蛋白酶和热休克蛋白等差异表达的蛋白质可能与鼻咽癌放射抗拒性相关。

鼻咽癌细胞MeDIP-Seq测序reads在染色体上分布差异的研究

目的探讨同源不同辐射抗拒鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞DNA甲基化差异,期望从表观遗传学角度阐述人鼻咽癌辐射抗拒的发生机制。方法采用Me DIP-Seq测序法对CNE2R/CNE2细胞进行测序,分析比较DNA甲基化水平差异区间的分布。结果 CNE-2R和CNE-2细胞甲基化分布差异主要集中在第5、6、7、9、13、17号染色体上,其中第5、6、13、17号染色体上为甲基化上调区间的密集区域,第7、9号染色体上为甲基化下调的密集区域。结论同源不同辐射抗拒鼻咽癌细胞CNE-2R和CNE-2细胞的甲基化水平存在差异;差异甲基化水平可能与辐射抗拒相关。

薏苡仁酯对同源不同辐射抗性鼻咽癌细胞增殖及凋亡的作用

探讨薏苡仁酯（coixenolide,CXL）对同源不同辐射抗性鼻咽癌细胞增殖及凋亡的影响,探讨其可能的作用机制。采用CCK-8法、DAPI染色法及流式细胞术检测CXL作用后CNE-2R和CNE-2细胞活性及凋亡的情况,Western blotting法检测凋亡相关基因的蛋白表达水平。CCK-8法显示CXL呈剂量-时间依赖性的抑制CNE-2R（24 h,48 h,72 h的IC_（50）分别为273.20 g/L,10.88 g/L和4.55 g/L）和CNE-2（24 h,48 h,72 h的IC_（50）分别为256.60 g/L,5.44 g/L和2.43 g/L）的细胞活性;DAPI染色显示CXL组细胞中观察到染色质浓缩、边集和分割成块状;与对照组相比,流式细胞术显示CXL作用于CNE-2R（（4.51依0.09）vs（11.68±3.54）,p〈0.05）和CNE-2（（5.27±0.14）vs（15.68±2.76）,p〈0.05）细胞凋亡率均明显增加;Western blotting法显示,CXL组Bax、Caspase-9、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP蛋白表达量较对照组均显著增加（p〈0.05）,Bcl-2蛋白表达量显著降低（p〈0.05）,Bcl-2/Bax比值降低（p〈0.001）。上述均表明CXL可抑制同源不同辐射抗性鼻咽癌细胞的增殖及诱导其凋亡,其作用机制可能与凋亡调节基因的表达变化有关。

miRNAs在放射医学研究中的应用

microRNAs（miRNAs）是一类内源性的非编码RNA，通过与靶mRNA特异性的结合而导致靶mRNA降解或抑制其翻译，对基因进行转录后调控，进而影响各种生命活动。大量研究表明，miRNAs与辐射致癌效应、辐射增敏效应、肿瘤辐射抗拒和辐射旁效应密切相关，已成为放射医学研究的热点。笔者就miRNAs及其在放射医学研究中的应用作一综述。