辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞炎症反应和氧化应激的影响

目的 探讨辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞炎症反应和氧化应激的影响。方法 建立小鼠海马神经元HT22细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型,不进行其他处理的作为模型对照(Con)组,使用不同浓度(0.31、0.62、1.25 mg/L)的辛芍组方处理建模后的HT22细胞,作为0.31 mg/L组、0.62 mg/L组、1.25 mg/L组。正常培养的HT22细胞作为正常(Normal)组。采用细胞计数(CCK)-8试剂盒检测细胞活性;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β炎症因子水平;采用试剂盒检测过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。采用Western印迹检测微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白(P62)、低氧诱导因子(HIF)-1α蛋白表达;采用荧光显微镜检测细胞自噬体数量。结果 与Normal组比较,Con组细胞OD值显著降低,TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高,MDA含量显著升高,CAT、SOD活性显著降低,LC3Ⅱ蛋白表达和自噬小体数量显著升高,P62蛋白表达显著降低,HIF-1α蛋白表达显著升高(均P<0.05);与Con组比较,0.31、0.62、1.25 mg/L辛芍组方组细胞OD值显著升高,TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低,MDA含量显著降低,CAT、SOD活性显著升高,LC3Ⅱ蛋白表达和自噬小体数量显著降低,P62蛋白表达显著升高,HIF-1α蛋白显著降低,且呈剂量依赖性(均P<0.05)。结论 辛芍组方可以显著降低缺血/再灌注损伤的神经细胞炎症因子水平,并抑制细胞的氧化应激和自噬活化。

辛芍组方对缺血再灌注损伤后神经细胞氧化应激及NF-κB信号通路的影响

目的观察辛芍组方对缺血再灌注损伤后神经细胞的氧化应激反应及核因子κB(NF-κB)信号通路蛋白表达的影响,探讨辛芍组方发挥脑保护作用的机制。方法培养PC12细胞,分为正常对照组、模型组及辛芍组方低、中高剂量组。模型组及辛芍组方各剂量组均以氧糖剥夺/复氧损伤方法建立缺血再灌注损伤模型,造模后辛芍组方低、中、高剂量组分别加入辛芍组方0.31、0.62、1.25 mg/L,均干预4 h。正常对照组及模型组不干预。采用ELISA法检测各组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA),采用Western blot法检测各组细胞内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX-2)及NF-κB信号通路相关蛋白IκBα、p-IκBα、p65蛋白表达。结果与正常对照组比较,模型组细胞内SOD水平降低、MDA水平升高(P均<0.01)。与模型组比较,辛芍组方中、高剂量组细胞内SOD水平均升高(P<0.05或0.01),辛芍组方各剂量组细胞内MDA水平均降低(P<0.05或0.01)。与正常对照组比较,模型组iNOS、COX-2蛋白表达均升高(P均<0.01);与模型组比较,辛芍组方各剂量组iNOS、COX-2蛋白表达均降低(P<0.05或0.01)。与正常对照组比较,模型组细胞质p-IκBα/IκBα值及细胞核内p65蛋白表达均增加(P均<0.01);与模型组比较,辛芍组方各剂量组p-IκBα/IκBα值、p65蛋白表达均降低(P<0.05或0.01)。结论辛芍组方对缺血再灌注损伤后的PC12细胞具有保护作用,其机制可能与减轻细胞内氧化应激反应、抑制NF-κB通路的活化有关。

辛芍组方对氧糖剥夺损伤的神经PC12细胞凋亡的影响及其机制研究

目的:考察辛芍组方对氧糖剥夺(OGD)损伤的神经PC12细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:采用连二亚硫酸钠培养PC12细胞建立OGD损伤模型,将OGD损伤的细胞分为模型组(空白培养基)、尼莫地平组(阳性药物,0.42 mg/L)和辛芍组方低、中、高浓度组[质量浓度分别为0.313、0.625、1.25 mg(生药)/L],并取正常细胞作为正常对照组(空白培养基)。各组细胞经药物作用4 h,再复糖复氧4 h后采用MTT法检测细胞存活率,比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)的释放量,流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位(MMP),并采用Western blot法检测细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:与正常对照组比较,模型组细胞的存活率、MMP、Bcl-2蛋白表达水平以及Bcl-2/Bax比值显著降低,而LDH释放量、细胞凋亡率以及Caspase-3、Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,辛芍组方可增加细胞的存活率和MMP,降低LDH的释放量和凋亡率,显著抑制Caspase-3和Bax蛋白表达水平,升高Bcl-2蛋白表达水平和Bcl-2/Bax比值;除辛芍组方低浓度组细胞的MMP、Bcl-2和Bax外,其余各给药组细胞上述指标差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:辛芍组方对OGD损伤诱导的PC12细胞凋亡具有抑制作用,其机制可能与减少LDH释放、稳定细胞MMP、调节凋亡相关基因的表达有关。

赤芍与辛芍组方中没食子酸、芍药内酯苷在大鼠体内的药动学比较

目的建立UPLC-MS法,进行辛芍组方与单味赤芍提取物没食子酸、芍药内酯苷大鼠药动学研究,探讨中药复方对药效成分体内过程的影响。方法色谱采用Waters BEH C18柱,0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱,质谱采用电喷雾电离源(ESI),扫描方式为选择性离子监测(SIR)。实验大鼠分别灌胃辛芍组方、赤芍提取物,测定不同时间点大鼠血浆没食子酸和芍药内酯苷浓度,采用DAS2.0药动学软件对参数进行拟合。结果没食子酸和芍药内酯苷线性关系、精密度、准确度和稳定性良好。没食子酸、芍药内酯苷在大鼠体内符合二室药动学模型,赤芍和辛芍组方两组没食子酸T max和T1/2z差异无显著性,芍药内酯苷的各药动学参数均具有一定差异。结论中药组方与单味药材体内药动学之间存在差异,其产生的原因可能与复方间的相互配伍以及复方组成有关。

辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的抗氧化、抗凋亡机制研究

该文制备了大鼠中动脉阻断（MCAO）局灶脑缺血再灌注损伤模型,来探讨辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤作用的抗氧化和抗凋亡机制。大鼠随机分为假手术组,模型组,辛芍组方低、中、高剂量组（0.31,0.62,1.25 g·kg-1）。静脉注射给药7d后,建立大鼠局灶脑缺血再灌注损伤模型,并考察大鼠神经行为学评分、脑梗死体积比;考察血清中活性氧（ROS）含量、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性、一氧化氮（NO）含量以及诱导型一氧化氮合酶（i NOS）的活性;并用qRT-PCR法、免疫组化及Western blot法测定海马CA1区中Bcl-2,Bax,caspase 3 mRNA和蛋白水平的变化。结果表明,辛芍组方能够显著改善脑损伤大鼠行为学评分（P〈0.01）、有效减小脑梗死体积（P〈0.01）、提高血清中SOD和GSH-PX活性（P〈0.01）、减少ROS和MDA的产生（P〈0.01）、抑制i NOS活性（P〈0.01）、降低NO释放量（P〈0.01）,上调Bcl-2的mRNA及蛋白水平（P〈0.01）,下调Bax和caspase 3的mRNA及蛋白水平（P〈0.01）。结果提示,辛芍组方可能通过抗氧化和抗凋亡途径起到脑缺血再灌注损伤保护作用。

基于大鼠脑缺血再灌注损伤模型建立辛芍组方中灯盏乙素和芍药苷的PK-PD结合模型

目的：建立辛芍组方中灯盏乙素和芍药苷的药代动力学-药效动力学（PK-PD）结合模型,为该组方的作用机制分析提供参考。方法：采用液质联用法测定大鼠脑缺血再灌注损伤模型给药后的不同时间点所得血浆样本中灯盏乙素和芍药苷的血药浓度,获得药时曲线;采用试剂盒测定不同时间点所得血浆样本中的2种药效指标超氧化物歧化酶（SOD）和乳酸脱氢酶（LDH）的浓度,获得时效曲线。采用Win Nonlin 6.4软件中的房室模型法对2种代表成分的药代动力学参数进行拟合,获得PK参数。在此基础之上,固定相关的药代动力学参数,对时效关系进行拟合,得PD参数;根据PD参数,建立辛芍组方中灯盏乙素和芍药苷的PK-PD结合模型。结果：当分别以SOD,LDH为药效指标时,得灯盏乙素的PK-PD模型分别为E=21.08＋5.49Ce/（Ce＋7 368.24）,E=211.98-89.13Ce/（Ce＋2 013.2）,芍药苷的PK-PD模型分别为E=20.02＋1.58Ce/（Ce＋0.02）,E=216.83-37.31Ce/（Ce＋0.04）,式中E为效应值,Ce为药物在效应室中的质量浓度。结论：SOD和LDH的浓度与灯盏乙素、芍药苷的质量浓度存在一定的相关性。辛芍组方及其主要活性成分灯盏乙素和芍药苷可通过提高SOD浓度和降低LDH浓度来发挥抗氧化作用,进而达到保护脑缺血再灌注损伤的目的。

辛芍组方中5个指标成分在大鼠体内的组织分布情况

目的：研究大鼠灌胃辛芍组方后其5个指标成分在体内的组织分布情况。方法：建立同时测定大鼠组织中灯盏甲素、灯盏乙素、灯盏乙素苷元、芍药苷、芍药内酯苷的UPLC-MS/MS,将辛芍组方灌胃给予SD大鼠（剂量25 g·kg-1）,分别于给药后20,90 min和12,24 h取其主要脏器和组织,采用UPLC-MS/MS测定各个时间点下5个指标成分在脏器和组织中的分布情况。结果：大鼠灌胃辛芍组方后,5个指标成分可广泛分布于大鼠各组织器官中。对于灯盏甲素,其质量浓度20 min时在肺和心中达到峰值,分别为48.2,59.8μg·L-1;90 min时在脑和小肠中达到峰值,分别为138.7,292.7μg·L-1;12 h时在肾和肌肉中达到峰值,为517.3,56.5μg·L-1;24 h时在肝脏中达到峰值,为352.9μg·L-1。对于灯盏乙素,其质量浓度20 min时在心中达到峰值,为38.3μg·L-1;90 min时在肺、脑、小肠和肾中达到峰值,分别为30.6,220.0,1 644.2,859.9μg·L-1;12 h时在肌肉中达到峰值,为86.9μg·L-1;24 h时在肝脏中达到峰值,为344.8μg·L-1。对于灯盏乙素苷元,其质量浓度90 min时在脑、小肠和肌肉中达到峰值,分别为875.4,52 468.0,5 114.7μg·L-1;12 h时在肺、心和肾中达到峰值,分别为609.7,1 718.6,1 736.5μg·L-1;24 h时在肝脏中达到峰值,为1 366.5μg·L-1。对于芍药苷,其质量浓度20 min时在肺、肝、肾和肌肉中达到峰值,分别为10 634.1,13 889.0,16 672.0,7 750.4μg·L-1;在90 min时,在心、小肠和脑中达到峰值,分别为6 851.1,870 563.9,7 474.0μg·L-1。对于芍药内酯苷,其质量浓度20 min时在肝和肾中达到峰值,分别为15 249.7,56 817.0μg·L-1,在90 min时,在肺、心、脑、小肠和肌肉中达到峰值,分别为4 211.5,4 425.3,4 631.3,631 871.5,5 673.6μg·L-1。结论：大鼠灌胃辛芍组方后,5个指标成分可迅速、广泛地分布在各组织器官中,但5个指标成分在各组织脏器中的达峰时间和分布存在一定差异,在肾脏和小肠中的分布最高,其次为肝和肌肉,同时在脑组织中也有分布,并且随着给药时间的延长,灯盏甲素、灯盏乙素和灯盏乙素苷元可能在大鼠的肝脏中会发生蓄积。

辛芍组方效应成分在正常和脑缺血再灌注损伤大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学分析

目的:研究辛芍组方中效应成分灯盏乙素、灯盏甲素和芍药苷在正常大鼠和大脑中动脉闭塞(MCAO)局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学,比较上述成分在不同状态大鼠肝微粒体中的体外酶代谢动力学差异。方法:制备不同状态大鼠的肝微粒体,将辛芍组方与大鼠肝微粒体进行孵育,选择UPLC-MS为分析手段,采用底物消除法,计算各成分在正常大鼠和MCAO大鼠肝微粒体中的酶反应动力学米氏常数(Km),最大反应速率(Vmax)及体外肝微粒体对药物的固有清除率(CLint),将各参数进行组间统计学分析。结果:灯盏乙素、灯盏甲素和芍药苷在正常大鼠体外肝微粒体中的Km[(0.597±0.065),(0.166±0.012),(0.640±0.046)μmol·L^-1]与MCAO大鼠中的Km[(0.798±0.031),(0.213±0.017),(0.499±0.029)μmol·L^-1]均明显不同;与正常组相比,MCAO大鼠体内的灯盏乙素和芍药苷的Vmax和CLint均明显减少(P<0.05,P<0.01),灯盏甲素的Vmax也显著降低(P<0.05)。结论:辛芍组方的效应成分在脑缺血再灌注损伤大鼠肝微粒体中的代谢速率降低、消除减慢。

基于大鼠脑缺血再灌注损伤模型建立芍药内酯苷的PK-PD模型

[目的]建立芍药内酯苷的药动学-药效学(PK-PD)模型。[方法]首先采用液质联用法测定大鼠脑缺血再灌注损伤模型给予辛芍组方后的不同时间点所得血浆样本中芍药内酯苷的药物浓度,获得药时曲线;同时采用试剂盒测定不同时间点所得血浆样本中的超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)含量,获得时效曲线。然后用Win Non Lin软件采用房室模型的分析方法对芍药内酯苷的药代动力学参数进行拟合,获得PK参数。在此基础之上,固定相关的药代动力学参数,对时效关系进行拟合,得到相关的PD参数,根据PD参数,建立辛芍组方中芍药内酯苷的PK-PD模型。[结果]当以SOD为药效指标时,可得辛芍组方中芍药内酯苷的PK-PD模型为E=21.04+(7.16×Ce)/(Ce+372.4);当以LDH为药效指标时,可得辛芍组方中代表成分芍药内酯苷的PK-PD模型为E=216.83-(37.31×Ce)/(Ce+0.04)。[结论]SOD和LDH的浓度与芍药内酯苷的浓度存在一定的相关性。芍药内酯苷可通过提高SOD、降低LDH发挥抗氧化作用来实现保护脑缺血再灌注损伤。

灯盏甲素在大鼠脑缺血再灌注损伤模型的PK-PD结合模型研究

本研究旨在建立辛芍组方中灯盏甲素的PK-PD结合模型。首先采用液质联用法测定大鼠脑缺血再灌注损伤模型给药后的不同时间点所得血浆样本中灯盏甲素的药物浓度,获得药时曲线;同时采用试剂盒测定不同时间点所得血浆样本中的两种药效指标(SOD和LDH),获得时效曲线。然后用Win Non Lin软件采用房室模型的分析方法对灯盏甲素的药代动力学参数进行拟合,获得PK参数。在此基础之上,固定相关的药代动力学参数,对时效关系进行拟合,得到相关的PD参数,根据PD参数,建立辛芍组方中灯盏甲素的PK-PD结合模型。当以SOD为药效指标时,可得辛芍组方中灯盏甲素的PK-PD模型为E=20.67+(1.22×Ce)/(Ce+5.58);当以LDH为药效指标时,可得辛芍组方中代表成分灯盏甲素的PK-PD模型为E=214.17-(32.72×Ce)/(Ce+0.08)。结果表明,SOD和LDH的浓度与灯盏甲素的浓度存在一定的相关性。辛芍组方及其主要活性成分灯盏甲素可通过提高SOD、降低LDH发挥抗氧化作用来实现保护脑缺血再灌注损伤。