4-羟基苯乙烯基吡啶为辣根过氧化物酶底物的酶荧光免疫传感体系测定布氏杆菌抗体

合成了一种新型辣根过氧化物酶(HRP)荧光底物-4-羟基苯乙基吡啶(pHSP),并首次将它运用于酶联荧光免疫传感体系.对pHSP化学性质的研究证实,pHSP在空气中较稳定,对HRP,H2O2的荧光响应性能优于传统HRP荧光底物,如对羟苯乙酸、Amplex Red和佳味醇等.在pH5.8的Britton-Robinson缓冲溶液中,pHSP本身只有极弱的荧光,在HRP-IgG催化下可被H2O2氧化成二聚体产物,该二聚体在300nm的激发光下能发射波长为437nm的强荧光,并且反应体系的荧光增加与HRP量在一定浓度范围内成线性相关.根据此原理,建立了兔布氏杆菌抗体的酶联荧光传感分析新方法.运用制备的传感装置测定兔布氏杆菌抗体的线性范围为6.3×10-11～1×10-8mol·L-1,抗体检出限为6.3×10-11mol·L-1,相对标准偏差为4.1%(n=11).pHSP的二聚体产物水溶性很低,利用设计的装置较好地解决了传统测定溶液体系方法灵敏度不高的问题.

合成染料与染料脱色过氧化物酶Il-DyP4相互作用的光谱分析

利用紫外-可见吸收光谱法和荧光光谱法,分析蒽醌类染料(reactive blue 19(RB19),reactive blue 4(RB4))、偶氮类染料(reactive violet 5(RV5),reactive black 5(RB5))及底物2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)与染料脱色过氧化物酶Il-DyP4之间的相互作用.紫外-可见吸收光谱法结果表明,Il-DyP4和上述底物之间均形成了复合物;荧光光谱法结果表明,上述底物均使Il-DyP4产生了荧光淬灭效应,且淬灭类型为静态淬灭,符合紫外-可见吸收光谱的结果.根据双对数方程■,计算出RB19,RB4,RV5,RB5,ABTS与Il-DyP4相互作用的表观结合常数(Ka)分别为:9.386 2×10^(4)L·mol^(-1)(298 K),5.615 7×10^(6) L·mol^(-1)(298 K),1.926 2×10^(6) L·mol^(-1)(288 K),5.277 8×10^(5) L·mol^(-1)(298 K),2.234 6×10^(5) L·mol^(-1)(298 K).热力学参数分析结果表明,上述底物与Il-DyP4的结合依赖于疏水相互作用,是自发的吸热过程.

吡罗红为底物的辣根过氧化物酶催化荧光反应测定葡萄糖

吡罗红在辣根过氧化物酶催化下可被过氧化氢氧化而使其荧光猝灭。在pH 7.2中性介质中,稳态催化速率由酶和底物浓度决定,催化体系服从Michaelis-Menten方程,用Lineweaver-Burk作图法求得米氏常数、最大反应速度、催化常数分别为2.4×10^(-5)mol·L-1,2.5×10^(-6)mol·L-1s-1,75.8 s-1。在最佳反应条件下,荧光F0/F的猝灭程度与过氧化氢浓度在0-3.6×10^(-7)mol·L-1范围内成线性关系,检测限为6.3×10^(-9)mol·L-1;当与葡萄糖氧化酶联用时,可定量检测葡萄糖,线性关系为0-8.0×10^(-7)mol·L-1,检测限为3.4×10^(-8)mol·L-1。方法用于分析人血清中葡萄糖含量,分析结果与苯酚-4-氨基安替比林法基本一致。

以变色酸2R为底物测定辣根过氧化物酶的研究

变色酸 2R(CT2R)是一种具有电化学活性的物质 ,在碱性条件下 ,该物质在滴汞电极上 - 6 6 0mV(vs.SCE)左右产生还原波 ,加入H2 O2 和辣根过氧化物酶 (HRP)后 ,该物质被氧化生成具有非电化学活性的物质 ,导致溶液中游离的CT2R浓度降低 ,相应还原波波高降低 ,HRP在一定含量范围内与伏安峰的降低值具有良好的线性关系。通过测定波高的降低值可测定HRP ,测定游离HRP的线性范围是 4 .0× 10 -5～ 4 .0× 10 -3 g/L。对酶促反应的动力学进行了研究 ,反应的米氏常数Km =1.38mmol/L ,最大反应速率Vmax=5 3.9nA/min。

四氨基铝酞菁作为过氧化物酶模拟酶新型红区荧光底物的研究

Tetra substituted amino aluminum phthalocyanine (TAAlPc) has been synthesized and used for the first time as a new red region fluorescent substrate for the determination of hydrogen peroxide catalyzed by peroxidase or mimetic peroxidase. Under optimum conditions, the calibration graph has a linear range of 0.0-3.0×10 -7 mol/L H 2O 2 with a detection limit of 3.7×10 -9 mol/L. The feasibility of TAAlPc as a new promising red region substrate in practical application has been proven in the determination of H 2O 2 in rainwater.The proposed method can largely minimize the interference that results from background fluorescence or scattering light and has a high analytical sensitivity.

叠氮化钠对辣根过氧化物酶的荧光猝灭机制的研究

研究了辣根过氧化物酶 (HRP)和叠氮化钠 (NaN3 )作用前后的荧光光谱变化。探讨了HRP的荧光猝灭机制 ,首次运用了HRP的荧光猝灭行为确认了HRP和NaN3 之间生成了配合物。计算了HRP和NaN3 之间生成的配合物的形成常数为 7 9× 10 8L·mol-1,结合位点数为 1。研究还发现 ,NaN3 与HRP的结合 ,影响了分子构象 ,使酪氨酸和色氨酸残基的微环境受到不同程度的影响。

基于葡萄糖/葡萄糖氧化酶/H_2O_2/L-酪氨酸/辣根过氧化物酶反应体系的荧光毛细分析法测定血糖

建立了葡萄糖(G)/葡萄糖氧化酶(GOD)/H2O2/L-酪氨酸/辣根过氧化物酶(HRP)新荧光反应新体系,并将此反应体系与荧光毛细分析法(FCA)结合,开发一种能够真正实现血糖测定的新葡萄糖酶荧光毛细分析法(GE-FCA)。经优选得到的新反应体系最佳条件为:GOD和HRP浓度均为2000U/L,L-酪氨酸浓度为1.0mmol/L,磷酸盐缓冲液的pH=8.5,反应温度为35℃,反应时间为20min。通过测定葡萄糖标准样品,得到GE-FCA法测定葡萄糖的线性范围是5.0～140μmol/L;相对标准偏差<4.0%;检出限为2.65μmol/L。本方法已成功用于临床血清样品中葡萄糖的测定,其回收率在98%～104%之间。GE-FCA荧光增强法操作简单,样品和试剂用量极少(9μL),线性响应范围宽、抗干扰能力强,易于普及推广。

罗丹明染料荧光猝灭法测定超痕量辣根过氧化物酶

在HAC-NaAC缓冲液中，辣根过氧化物酶催化H2O2氧化KI生成I2，过量的I^-可与I2结合形成I3，而I3^-分别与罗丹明S（RhS），罗丹明G（Rh6G），罗丹明B（RhB）和丁基罗丹明B（b-RhB）反应导致四体系在580，580，554和554nm处的荧光强度降低。在选择条件下，对于RhS，Rh6G，RhB，b-RhB四体系，辣根过氧化物酶的浓度分别在8～6400，40～4000，32～3200，40～6400Pg·mL^-1范围内与其荧光猝灭强度成线性关系，其检出限分别为3．2，3．0，2．4，3．7pg·mL^-1。其中RhS催化体系较好，用于酶联免疫乙肝试剂盒中辣根过氧化物酶活力的测定，结果比较满意。

催化荧光光度法测定辣根过氧化物酶及甲胎蛋白

建立了催化动力学荧光光度法测定辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）及人甲胎蛋白（ＡＦＰ）的新方法。在含ＴｒｉｔｏｒＸ－１００的磷酸盐缓冲溶液中，辣根过氧化氢氧化邻苯二胺的产物２，３－二氨基吩嗪的荧光强度有明显的增强。在一定的实验条件下，该产物的荧光强度与ＨＲＰ的量成正比，方法对ＨＲＰ的线性范围为１０～２００pg，线性相关系数为０．９９５６，最低检出下限可达８pg，其相对标准偏差为３．２％（n＝１０）。

过氧化物酶新型荧光底物3,4-二氢-2(1H)-喹喔啉酮的反应机理及性能的研究

合成了过氧化物酶新型荧光底物3，4-二氢-2（1H）-喹喔啉酮（DHQXL）．在过氧化物酶催化下，该化合物可被H2O2氧化生成强荧光物质2（1H）－喹喔啉酮（QXL）．用高压液相色谱法分离得荧光产物纯品，经核磁共振谱和质谱证实其结构，确证了提出的酶催化反应机理．对该化合物作为荧光底物的性能研究表明，它是一个很有应用前景的过氧化物酶的新型荧光底物．

白藜芦醇作辣根过氧化物酶底物的布氏杆菌抗体酶联免疫传感器研究

一种纯天然产物白藜芦醇用作辣根过氧化物酶（HRP）底物。对其化学性质的研究证实，白藜芦醇在空气中较稳定，对HRP、H2O2的电化学响应性能优于传统HRP底物，对人体无毒害。白藜芦醇在HRP催化下可被H2O2氧化成醌，产物醌在电极上于一376mV处可被还原，其电流的大小与HRP的浓试在一定浓度范围内呈线性相关。将兔布氏杆菌抗原包埋在石墨．石蜡基质中制备了测定兔布氏杆菌抗体的电化学酶联免疫传感器，该传感器测定兔布氏杆菌抗体的线性范围为3×10^-4～1．65×10^-2g／L；检出限为1×10^-4g／L；RSD为4．6％。本方法制备免疫传感器的电化学性能稳定，抗原活性保持良好。

水中粪大肠菌群的测定-酶底物法与荧光光度法的比较

采用酶底物法和荧光光度法对水源水、景观水、污水中粪大肠菌群进行检测。通过检测高浓度标准样品与低浓度标准样品发现,酶底物法和荧光光度法相比,荧光光度法检测结果相对误差更小,跟接近于真值,其结果更为准确。荧光光度法相对标准偏差低于酶底物法,表明荧光光度法检测的稳定性优于酶底物法。通过选取不同类型的实际样品分别用2种方法测定,并对结果进行统计学分析,发现2种方法在统计学中具有相关性,无显著差异。采用荧光光度法测定粪大肠菌群具有测定时间短,减少了人为误差,同时避免了测定时间对结果的影响,特别适合应急检测。

以OT为底物固体电极伏安法测定辣根过氧化物酶及其标记物的研究

以玻碳电极为工作电极研究了邻联甲苯胺(OT)为底物微分脉冲伏安法测定辣根过氧化物酶(HRP)及其标记物的方法。HRP能够催化H2O2氧化OT,其反应产物在玻碳电极上-0.58V(vs.Ag/AgCl)左右被还原产生一个灵敏的还原峰,还原峰电流随着酶浓度的增大而增大,借助此还原电流可以测定HRP,并进而可用于以HRP为标记物的酶免疫分析。对酶催化反应条件和酶催化反应产物的测定条件进行了详细的研究,在最佳实验条件下测定游离HRP的线性范围是2.0×10-9～4.0×10-8g/mL,检出限为1.6×10-9g/mL;测定游离的酶标记物(IgG HRP),稀释范围为1∶2000～1∶400000,最大稀释比为1∶400000。

辣根过氧化物酶催化反应在荧光分析中的应用

辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）催化反应对Ｈ２Ｏ２具有很高的专一性。在ＨＲＰ催化荧光分析中讨论荧光底物的结构，将有助于揭示酶催化反应机理。

以对氨基联苯为底物伏安法测定辣根过氧化物酶

伏安酶联免疫分析法是将伏安法与酶联免疫分析法相结合的一种分析方法，以测定标记酶的活性为基础，进而应用到各种模式的酶联免疫分析中，已经应用于植物病毒血清学的检测和动物病毒抗原抗体的测定等多个领域。辣根过氧化物酶（HRP）的测定对免疫学和组织化学的研究及临床疾病诊断具有重要的意义和广泛的应用前景。本文提出了以对氨基联苯为底物的伏安酶联免疫分析新体系，建立了测定HRP的伏安酶联免疫分析新方法。

新型过氧化物酶荧光底物的合成及其性能的研究

合成了辣根过氧化物酶的５种荧光底物，它们分别是：Ｎ，Ｎ′—二氰甲基邻苯二胺（ＤＣＭ－ＯＰＡ），３，４—二氧喹喔啉－２（１Ｈ）－酮（ＤＨＱ），３－甲基－３，４－二氢喹喔啉－２（１Ｈ）－酮（ＭＤＨＱ），３，４－二氢喹喔啉－２（１Ｈ）－酮－６－羧酸（ＤＨＱ－６－Ａ）及３－甲基－３，４－二氢喹喔啉－２（１Ｈ）－酮－６－羧酸（ＭＤＨＱ－６－Ａ）。其中荧光底物ＤＣＭ－ＯＰＡ，ＤＨＱ和ＭＤＨＱ都可以很容易地进行大量纯品的制备。我们用流动注射分析法对合成底物和已有的最佳荧光底物在ＨＲＰ及其模拟酶氯化血红素催化体系中的性能进行了比较研究。结果表明，ＤＣＭ－ＯＰＡ和ＭＤＨＱ是合成的５种底物中最好的两个，而对羟基苯丙酸（ｐ－ＨＰＰＡ）和对羟基苯乙酸（ｐ－ＨＰＡ）优于高香草酸（ＨＶＡ）和酪氨。底物ｐ－ＨＰＰＡ和ｐ－ＨＰＡ与合成底物ＤＣＭ－ＯＰＡ和ＭＤＨＱ体系在对过氧化氢的分析方法性能相当，最低检测限都在１～１０ｎｍｏｌ／Ｌ之间。对酶的检测，ＤＣＭ－ＯＰＡ是所有研究的底物中最灵敏的，上述两种合成底物保存在４℃的冰箱中都可以稳定一个月以上。

狗坐骨神经荧光素及辣根过氧化物酶逆行追踪实验研究

目的 :确定狗周围神经逆行示踪试验的最佳示踪剂及示踪时间。方法 :用快蓝 (FB)、碘化丙啶 (PI)及辣根过氧化物酶 (HRP)注射于正常狗坐骨神经 ,选择不同时间观察脊髓及相应脊神经背根神经节的神经元。结果 :14天时神经元胞体开始出现 FB,随后荧光逐渐加强和阳性标记细胞逐渐增多 ;而 PI及HRP追踪组 ,仅少量胞体中出现很细的 HRP未能观察到 PI。结论 :狗的周围神经逆行示踪试验最好选择易溶解、激发波长较短的荧光素 ,并在体内存留的时间要长 ,以 FB较为合适。

非水介质中辣根过氧化物酶（HRP）荧光活性测定法

建立了一种分析ＨＲＰ催化活力的新方法。该方法基于单体（底物）、聚合物（产物）的荧光发射光谱不重叠，使用荧光光谱仪，通过测量底物荧光淬灭来检测ＨＲＰ在非水介质中（二氧六环－水、乙醇－水、丙酮－水体系）催化酚类、芳香胺类物质聚合的活力。此方法迅速、简便，结果是定量并可重复的，并能定量地计算底物转化率。

基于氨基化石墨烯量子点荧光比率法超灵敏检测辣根过氧化物酶

荧光比率法超灵敏检测辣根过氧化物酶传感器的构建主要基于酶催化邻苯二胺氧化生成2,3-二氨基吩嗪,生成的2,3-二氨基吩嗪能猝灭氨基化石墨烯量子点440nm处的荧光强度,同时伴随2,3-二氨基吩嗪本身在553nm处的荧光信号增强。随着辣根过氧化物酶浓度的增加,2,3-二氨基吩嗪位于553nm处的荧光不断增强且氨基化石墨烯量子点440nm处的荧光逐渐减弱,形成荧光比率信号。当辣根过氧化物酶浓度在2~800fM范围时,其荧光比率信号与辣根过氧化物酶的浓度具有较好的线性关系,对辣根过氧化酶的检出限为0.21fM。该传感器具有良好的选择性和抗干扰能力,并能实现检测过程的可视性。

辣根过氧化物酶和荧光碳点的复合物研究

辣根过氧化物酶(HRP)是一种来源于辣根的含有铁离子的糖蛋白,可用于生化分析且在过氧化氢存在时能催化苯酚等物质氧化,HRP可与许多物质复合进而改善性能并拓宽其应用。采用一步水热法合成了平均尺寸约2 nm的氟掺杂的荧光碳点(F-CDs)。所得F-CDs在紫外灯下发黄绿色荧光且具有明显的激发光依赖性和浓度依赖性,以硫酸喹啉盐为参比计算出其相对量子产率高达45.6%。研究表明,F-CDs在Hela细胞内具有较好显影性能,F-CDs可与HRP形成稳定的复合物(F-CDs/HRP),该复合物不仅保留酶氧化2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)的能力,还保留着F-CDs优异的荧光性能。此外,加入过氧化氢的浓度影响F-CDs/HRP催化氧化ABTS的能力。在低温如4℃时,F-CDs/HRP复合物仍然可以迅速催化氧化ABTS,能通过溶液显色程度来定性分析F-CDs/HRP中HRP的催化活性。因此,F-CDs/HRP复合物有应用于免疫荧光分析的潜力。