1株绵羊边界病病毒的分离鉴定与序列分析

对华东地区某羊场采集定点监测的绵羊血液样品进行边界病的感染情况调查。通过RT-PCR方法检测瘟病毒5′-UTR基因,发现1只绵羊的血清样品在不同时间检测均为阳性,证实其为边界病病毒(BDV)持续性感染。将该阳性血清样品接种MDBK细胞,进行病毒分离鉴定。通过Npro基因RT-PCR扩增、电镜观察、病毒全基因组序列分析,并对分离毒株5′-UTR和Npro基因进行遗传进化分析。结果显示,该毒株在MDBK细胞上盲传至第8代,不发生细胞病变。RT-PCR扩增获得Npro基因预期大小片段,电镜观察以及测序分析表明成功分离出1株BDV,将其命名为JSLS12-01。设计覆盖BDV全基因组的6对引物,RT-PCR扩增并测序,该分离株全基因组序列大小为12 227bp(GenBank登录号为KC963426)。序列比对结果显示,该毒株基因组序列和氨基酸序列与已有BDV分离株之间相似性分别为72.3%~80.4%和80.1%~89.7%。5′-UTR和Npro基因系统进化分析显示,该分离株与BDV 3参考毒株亲缘关系最近,相似性最高分别为87.7%和75.8%。结果证实从绵羊血液样品中鉴定并分离到1株ncp型BDV分离株,经序列分析表明该毒株属于BDV 3亚型。

山东省外观健康羊群中检出羊边界病病毒

2014年从山东省外观健康的牛羊采集鼻拭子样品共707份,提取其RNA,用流感病毒特异性引物进行RT-PCR检测。对RT-PCR扩增的阳性产物进行序列测定,意外发现其中1份羊拭子样品含有羊边界病病毒,并且该结果得到其他试验验证。结合我国2012年首次在安徽和江苏两地检出该病毒,以及当前我国羊群流通情况,推测该病毒可能在我国有所存在。该调研结果对分析各类RT-PCR检测的假阳性产生原因,有参考意义。并提示RT-PCR检测结果难以作为疫病或感染病诊断的确切依据。其诊断结果有时需要用荧光探针或测序进行进一步鉴定。

边界病病毒E2蛋白质的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

边界病病毒(Border disease virus,BDV)是导致绵羊和山羊繁殖障碍的重要病原。为了建立检测BDV特异抗体的ELISA方法,本研究将BDV基因克隆入原核表达载体p ET-32a(+),并构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白质。以纯化的重组表达蛋白质为抗原,建立间接ELISA(r E2-ELISA)检测方法。通过反应条件优化,确定抗原包被浓度4.0μg/ml;封闭液为20 g/L BSA;血清最佳稀释度为1∶50,孵育1 h;二抗最佳稀释倍数为1∶30 000,作用45 min;以TMB为底物显色10 min。用该ELISA方法检测瘟病毒属的CSFV、BVDV阳性血清,结果均为阴性。对187份山羊血清样品进行临床检测,与Svanova试剂盒检测结果阳性符合率为76.25%,总符合率为74.87%;上述检测方法同时与Western blot鉴定结果进行比较,结果显示,Western blot结果与r E2-ELISA检测结果的符合率为79.55%,高于与Svanova试剂盒检测的符合率(72.73%)。表明建立的间接ELISA检测方法可适用于临床BDV血清样品的抗体检测。

土耳其小反刍动物感染的边界病病毒(BDV)是一个新的BDV亚型

绵、山羊血样采自土耳其的艾丁和布尔杜尔省的8个小反刍动物群,应用抗原捕获ELISA法检测其是否感染边界病病毒。对临床诊断为患病的羔羊,记录其病理和免疫组化特征。阳性BDV羔羊的尸检结果显示为,被毛异常,低髓鞘形成的非化脓性脑脊髓炎引发了后肢麻痹。免疫组化检测结果发现,脑的所有部分（包括小脑、大脑半球和中脑）都有边界病病毒抗原存在。

边界病病毒RT-PCR检测方法的建立和应用

边界病(border disease)由边界病病毒(border disease virus, BDV)引起,导致绵羊和山羊持续感染和繁殖疾病,2012年在国内首次报道,但目前尚无特异的RT-PCR方法对该病原进行检测。本研究通过比对黄病毒科瘟病毒属病毒的全基因组序列,以3′-UTR基因为靶基因,设计了特异扩增BDV的引物。通过构建重组质粒pMD18-T-BDV,以其作为标准品建立了BDV的RT-PCR检测方法。进一步优化该方法的反应条件,并进行特异性、敏感性及临床样品检测。结果显示,该方法在退火温度48~60℃时均可特异扩增BDV,通过检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)、牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)和猪瘟病毒(CSFV)提取的RNA,该方法可特异扩增BDV而对其他同属病毒检测均呈阴性,表明其特异性良好;同时,该方法具有良好的敏感性,最低检出限可达10~1拷贝/μL,敏感性极高。利用该方法检测BDV持续感染羊和人工感染羊,发现持续感染羊的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结、卵巢、脑等器官均可检测到BDV,而人工感染羊只能在感染3~7 d的血液和淋巴结中检测到病毒RNA,其他器官中未检测到病毒。本研究建立了特异检测BDV的RT-PCR方法,并证明了BDV在持续感染羊和一过性感染羊中的病毒分布情况,为其可能的排毒途径提供了依据。

羊边界病致病机制及宿主嗜性变化的研究进展

羊边界病病毒(border disease virus,BDV)属于黄病毒科瘟病毒属,经常在牛、羊等反刍动物群体间广泛流行传播,能以多种动物为宿主且对健康动物具有一定危害。BDV感染反刍动物可引起持续性感染和免疫抑制,给畜牧业造成严重危害,且在多个国家和地区呈现出一定的流行性趋势。目前尚无公认的有效疫苗来预防BDV,所以如何科学饲养以及做好安全防控就成了重中之重。本文对BDV在牛群、羊群内的传播进行研究分析,有助于人们对BDV可能造成的风险进行预估并进行防控。因此,从BDV的分子生物学、流行现状、流行病学、临床症状以及与牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的混合感染来进行研究分析,有助于人们深入了解BDV致病及传播扩散的生物学机制,为该病的诊断、防治和疫苗研发提供新思路和策略。

边界病

本文依据众多资料，对羊边界病的病原学、流行病学、临床症状、发病机理、病理学、免疫学、诊断及控制作了全面概述。

用ELISA检测绵羊和猪慢病毒感染

英国学者Graham等应用ELISA对北爱尔兰地区绵羊和猪慢病毒感染进行血清学调查。对10个地区92个畜群918头母羊血清检测,发现为边界病病毒阳性的有28个畜群(阳性率为30.4％)的49头母羊(阳性率为5.3％),其畜群阳性范围从0—70％不等,但阳性畜群中阳性数却没有差异。在阳性畜群中,平均阳性率为17.5％,最高为40％。对14份阳性血清进行牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型(BVDVI)

牛病毒性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法

牛病毒性腹泻病病毒(BVDV)为一类黄病毒科、瘟病毒属的单股正链RNA病毒。该病毒在血清学上与猪瘟病毒(CSFV)及羊边界病病毒(BDV)存在交叉反应。此类病毒具有突破宿主特异性交叉感染的能力,不仅感染牛,还可感染其他动物。BVDV的存在对养殖生产造成很大危害。牛血清制备生物制品可能存在BVDV感染和潜在感染的风险。基于此,本文分析了牛病毒性腹泻/黏膜病病毒荧光定量PCR检测方法,以期为相关人员提供参考。

江苏部分地区羊群边界病流行情况调查

本实验室从安徽某羊场发生腹泻的山羊病料中检测分离到边界病病毒（borderdiseasevirus，BDV），证明BDV在我国羊群中存在。为了进一步了解BDV在江苏羊群的流行情况，本研究收集江苏部分地区发生腹泻和健康羊群的血清和组织样品，采用RT—PCR方法进行检测，并对阳性样品进行病毒的分离鉴定，测定分离毒株5’-UTR基因片段，与其他已报道的毒株进行同源性比较并绘制进化树。结果表明有27．4％（29／106）样品呈阳性，不N羊场BDV阳性率为0～67％，共分离到4株不同的BDV毒株，它们之间的同源性为73．9％～95．6％，而与其他BDV毒株的同源性为66．2％～91．6％。进化分析表明AH12-02与其他各毒株均较远，形成单独的分支，另3个毒株与BDV3型毒株关系最近。采用ELISA试剂盒对血清样品BDV抗体进行检测发现不同羊场抗体阳性率存在较大差异（0～100%），还有抗体阴性持续感染个体的存在。以上结果丰富了我国BDV分子流行病学数据，为进一步探索BDV在我国羊群中的流行情况奠定了基础。