TGF-β1诱导的上皮间质转化对肝癌细胞系中边缘群细胞的调控

目的:观察转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的上皮间质转化(EMT)对SMMC-7721中SP细胞的影响.方法:常规培养人肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2,利用流式细胞术分析肝癌细胞系中SP细胞的含量并分选出SP细胞,Western blot检测ABCG2蛋白的表达.TGF-β1诱导肝癌细胞SMMC-7721,动态观察细胞形态学变化,Western blot和免疫荧光检测EMT相关指标钙粘蛋白(E-cadherin)的表达,通过流式细胞仪分析TGF-β1诱导前后SP细胞含量的变化.结果:利用流式细胞术成功建立了肝癌SP细胞分选体系.检测发现,SMMC-7721中SP细胞含量为4.3%,Western blot显示该SP细胞ABCG2蛋白表达明显上调.而HepG2中未能检测出SP细胞.TGF-β1诱导72h后SMMC-7721细胞发生上皮间质转化,Western blot和免疫荧光检测发现E-cadherin蛋白的表达下调,同时SP细胞含量也明显降低.结论:不同肝癌细胞系中SP细胞含量的差别可能与细胞系的遗传背景和性质不同有关.EMT可能抑制了肿瘤干细胞的增殖,促进肿瘤细胞向侵袭和转移的方向发展.

大鼠小肠黏膜边缘群细胞的生物学研究

目的:分离大鼠胎鼠小肠黏膜来源的边缘群(SP)细胞,并分析其生物学特性。方法:取Wistar大鼠胎鼠小肠全长,按文献[3]方法制作小肠黏膜的类器官片段并制备成单细胞悬液。使用Hoechst33342和PI染色后用流式细胞仪分选SP细胞。提取分选前后的细胞总RNA和蛋白,用实时定量PCR及Western-blot方法分别检测其中MSI-1RNA及MSI-1蛋白的表达水平。结果:大鼠胎鼠来源的小肠黏膜单细胞悬液中包含一个特定的细胞群体—SP细胞,染色液中加入维拉帕米后,SP细胞被阻断后消失。定量PCR检测显示SP细胞中MSI-1mRNA水平是分选前的8.125倍,是非SP细胞的20.077倍。Western-blot结果显示MSI-1蛋白水平明显高于分选前。结论:大鼠胎鼠的小肠黏膜SP细胞富集小肠黏膜干细胞,与小鼠来源SP细胞生物学特性基本一致。

新生小鼠肠边缘群细胞蛋白质组双向电泳图谱的差异表达

目的筛选肠道干细胞特征性的差异蛋白质或蛋白质群。方法采用双向凝胶电泳方法分离新生小鼠肠边缘群细胞与肠上皮细胞总蛋白,表达差异超过1.5倍的为差异蛋白质。结果成功建立小鼠肠边缘群细胞与肠上皮细胞的双向电泳图谱,筛选出差异蛋白点39个。结论小鼠肠干细胞与上皮细胞的蛋白表达谱存在差异,有可能成为潜在的、有应用价值的肠道干细胞鉴别分子标志。

Huh7细胞中边缘群细胞分选及其增殖分裂能力的研究

目的:探讨Huh7细胞中边缘群细胞的分选及边缘群细胞在增殖及分裂能力方面与非边缘群细胞的差异,为肝癌的治疗探索新的思路。方法:采用流式细胞仪分选Huh7细胞中的边缘群细胞和非边缘群细胞,用荧光显微镜观察其胞内Hoechst33342荧光染色强度差异;以半定量RT-PCR测定ABCG2 mRNA表达水平的差异;应用免疫荧光染色检测ABCG2蛋白表达的差异并观察其增殖和不对称分裂能力的差异。结果:非维拉帕米处理组边缘群细胞比例约为2.22%,经维拉帕米阻断后边缘群细胞比例减少至0.74%;边缘群细胞中Hoechst33342的荧光强度明显较非边缘群细胞弱,在边缘群细胞中ABCG2 mRNA表达水平是非边缘群细胞的4.32倍(P<0.01),增殖能力是非边缘群细胞的2.7倍(P<0.01),且边缘群细胞能产生ABCG2(+)和ABCG2(-)子代细胞,而非边缘群细胞只能产生ABCG2(-)子代细胞。结论:Huh7细胞中存在少量边缘群细胞(2.22%),其增殖能力较非边缘群细胞强且具有不对称分裂能力(自我更新和定向分化),具有肿瘤干细胞的特性;因此边缘群细胞分选可以作为肿瘤干细胞分离的一种方法,并且在肿瘤的耐药和进展中具有更重要作用,进一步探讨针对Huh7边缘群细胞生物学行为的研究有望开辟肝癌治疗的新思路。

新生小鼠肠边缘群细胞蛋白质组的差异蛋白分析

[目的]筛选肠道干细胞特征的差异蛋白质或蛋白质群。[方法]采用双向凝胶电泳方法分离新生小鼠肠边缘群细胞与肠上皮细胞总蛋白,选择差异表达超过1.5倍的蛋白质进行质谱分析及数据库搜索、鉴定。[结果]成功建立小鼠肠边缘群细胞与肠上皮细胞的双向电泳图谱,筛选出差异蛋白点39个,质谱分析及数据库搜索共鉴定出32种蛋白质。[结论]小鼠肠干细胞与上皮细胞的蛋白表达谱存在差异,鉴定出的32种蛋白质有可能成为潜在的、有应用价值的肠道干细胞鉴别分子标志。