达托霉素及其衍生物生物合成的研究进展

随着高致病耐药菌的不断出现,临床上对新抗生素的需求十分迫切。达托霉素作为环脂肽类抗生素的第一个产品对耐药菌有很好的杀菌效果,且制剂用药方便,毒副作用小,被公认为病原菌最后一道防线——万古霉素的最佳替代品。本文在介绍达托霉素的理化特征和抗菌活性、合成基因簇的研究成果的基础上,重点对达托霉素及其衍生物的研究状况进行了综述,对达托霉素的生产及其衍生物的开发进行了展望:结合系统生物学为已有的达托霉素产生菌进一步进行代谢工程改造提供指导;通过合成生物学使达托霉素衍生物成为新型抗生素。

萝卜赤霉素生物合成和信号转导相关基因的全基因组鉴定及表达分析

赤霉素途径是植物开花调控中的一条重要途径。为了解赤霉素途径相关基因在萝卜开花调控中的作用,利用生物信息学方法对萝卜赤霉素生物合成和信号转导相关基因的结构、理化性质、染色体分布、启动子顺式作用元件和组织特异性表达进行了分析,并对不同开花期萝卜材料中这些基因的表达水平进行了实时荧光定量PCR检测。结果表明,萝卜基因组含有46个赤霉素生物合成和信号转导相关基因,CPS、KS、KO、KAO、GA20OX、GA3OX、GA2OX、GAI、RGA、RGL、GID1、SKP2分别有2,1,2,2,9,5,12,1,1,4,3,4个,它们不均匀分布于9条染色体上,其编码蛋白质分子质量为21.32~127.80 ku,等电点为4.72~9.04;基因结构和保守结构域分析发现,这46个基因的外显子数为1~21个不等,且一些保守基序为大部分基因所共有。启动子顺式作用元件分析表明,这46个基因的启动子含有与光、赤霉素、生长素、ABA、SA、低温、干旱等响应的顺式作用元件。利用萝卜基因表达数据库分析发现,这46个基因在不同组织和不同发育时期的表达量不同;实时荧光定量PCR检测表明,这些基因在早开花材料心里美萝卜和晚开花材料野萝卜中的表达量有明显差异,暗示其可能与萝卜的生殖生长有较密切的关系。

达托霉素生物合成过程的调控机制研究进展

微生物是天然产物类药物的重要来源之一,其中许多链霉菌来源的抗生素类药物一直活跃在对付细菌感染的前沿阵地。然而随着“超级细菌”的陆续发现,以及新药研发速度的滞缓,人类尚缺乏“超级细菌”的最终治疗手段。达托霉素是由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)经发酵产生的一种新型环脂肽类抗生素,由于其独特的结构及特殊的药物机制,被视为多重耐药革兰阳性细菌引起的重症感染的最后一道防线。然而在工业发酵过程中,达托霉素的生物合成水平很低,有极高的提升潜力。本文总结了近年来国内外相关达托霉素合成的调控机制研究,包括调控蛋白的挖掘、途径特异性调控机制、级联调控途径、脂酰前体合成途径、GBL信号途径与磷酸双组分系统及其协同调控机制等,揭示了次级代谢调控网络的复杂性,并阐述了通过调控通路重构实现达托霉素优质高产的策略。

硫霉素生物合成酶基因克隆的研究

利用NTG诱变从硫霉素产生菌中获得了生物合成阻断变株Y_3。通过对Y_3变株原生质体形成、再生条件及DNA转化的研究,初步建立了以变株为受体的克隆系统,以pIJ680为载体,从硫霉素产生菌S.cattleya中鸟枪克隆,获得了能使Y_3变株恢复产生硫霉素的酶基因。根据对Y_3积累的中间产物的分析,认为该酶基因可能与硫霉素生物合成过程中肽的环化作用有关。重组质粒分子大小为9.8kb左右,插入片段大小为4.5kb,分子杂交试验证明插入片段来源于硫霉素产生菌S.cattleya。

红霉素生物合成的生物化学和基因学

从基因重组技术问世以来,对红霉素(大环内酯类抗生素)生物合成的生物化学和基因学的研究到目前已经累积了大量的研究结果。就这2个领域中对红霉素生物合成的研究历史、研究现状和研究前景(组合生物合成)作以简要的介绍。

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因——sanH和sanI的研究

通过反向遗传学方法克隆到圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因簇中约 7 0kb的DNA片段。该片段除含有尼可霉素生物合成基因sanF外 ,对sanF上游约 2 2kb的BglⅡDNA片段进行序列测定及分析表明 ,还含有两个完整的开放阅读框 (ORF)。ORF1由 1 2 33个核苷酸组成 ,ORF2由 1 95个核苷酸组成 ,它们分别编码由 41 0个氨基酸残基和 64个氨基酸残基组成的蛋白质 ,依次命名为sanH和sanI。蛋白序列数据库比较结果表明 ,SanH和SanI与浅灰链霉菌 (Streptomycesgriseolus)中共转录的细胞色素P450 (cytochromeP450 )和铁氧还蛋白 (ferredoxin)有较高的同源性 ,一致性分别为 46%和 56% ,相似性分别为 62 %和70 %。基因功能研究表明 ,sanH基因的破坏虽不影响圈卷产色链霉菌产生的尼可霉素的生物活性 ,但该基因可能参与了尼可霉素羟基化反应的生物合成。

吸水链霉菌17997格尔德霉素部分生物合成基因簇的克隆和分析

吸水链霉菌17997(Streptomyceshy groscopicus17997)是我所从中国云南土壤中分离到的格尔德霉素(geldanamycin,GDM)产生菌,GDM具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性,但其肝毒性和水溶性差的缺点限制了其在临床上的应用。为了实现对GDM结构的生物学改造,首先要获得GDM的生物合成基因。根据GDM后修饰基因——氨甲酰基转移酶基因(gdmN)的保守序列筛选S.hygroscopicus17997的柯斯质粒基因组文库,共获得6个阳性克隆,选择CT-4阳性柯斯质粒进行亚克隆和测序,又通过PCR延伸的方法获得了与CT4连锁的将近5kb的外源序列,共获得28.356kb的外源DNA序列,其中包含了13个可能阅读框架,通过同源比较证实该序列与S.hygroscopicusNRRL3602中的GDM生物合成基因有很高的同源性。为进一步研究GDM生物合成基因的功能,并通过组合生物学的方法改造GDM的结构奠定了基础。

尼可霉素(Nikkomycins)多组分结构及其生物合成相关基因的研究进展

尼可霉素是一种新的抗真菌抗生素 ,在分离到的 2 0多种活性单组分中 ,X、Z、I、J为主要生物活性组分。本文介绍了尼可霉素的结构 。

麦迪霉素生物合成基因克隆研究

利用穿梭粘粒载体pNJ_1组建了麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarofaciens 1748的基因文库,用与麦迪霉素生物合成有类似途径的放线紫红素聚酮合成酶基因Act Ⅰ,Act Ⅲ为探针,从麦迪霉素产生菌的基因文库中,获得了与Act Ⅰ,Act Ⅲ基因有同源性的阳性克隆,对其中PCNSB12、6C5及11E11克隆DNA进行了酶切分析,其分子量分别为36kb,48.5kb及41.6kb。PCN6C5 DNA中包含有PCN 8812的全部DNA片段,PCN JIEII与PCN 8B12及PCN 6C5有6.75kb的重叠区。通过分子杂交实验,初步将麦迪霉素聚酮合成酶基因定位在PCN 8812 DNA的EcoR Ⅰ-BamH Ⅰ 4.02kb片段上(与Act Ⅲ基因有同源性)及PCN 8812(6C5),PCN11E11DNA Bg Ⅲ-Bg Ⅲ 2.42kb与PCN11E11 Bgl Ⅱ-Bgl Ⅱ 10kb片段上(与Act Ⅰ基因有同源性)。PCN 8812及PCN 6C5克隆DNA在麦迪霉素聚酮合成酶基因缺陷型变株Streptomyces mycarofaciens var.68及不产抗生素的变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK24受体菌的表达产物,经TLC及HPLC等分析表明与麦迪霉素标准品相似。

Tn4560在圈卷产色链霉菌中的转座及其在尼可霉素生物合成相关基因克隆中的应用

采用常规转化方法用来自天蓝色链霉菌J1 5 0 1的质粒pUC1 1 6 9(pMT6 6 0∷Tn45 5 6∷vph)多次转化尼可霉素产生菌圈卷产色链霉菌野生型 71 0 0的原生质体 ,均未得到转化子。采用限制性热衰减法于 5 0℃ ,3 0min溶菌制备 71 0 0的原生质体 ,获得了转化子 ,但转化频率极低 ,只有 0 4个转化子 μgDNA。用来自 71 0 0的pUC1 1 6 9再转化不含pUC1 1 6 9的 71 0 0原生质体 ,转化频率提高 1 0 3 ～ 1 0 4 倍。于 3 9℃ ,MM Vio条件下培养携带有pUC1 1 6 9的 71 0 0孢子 ,Tn45 6 0发生转座 ,筛选到 40 6 8个转座菌落 ,并从中得到 8株尼可霉素阻断突变株 ;对这 8株突变株的总DNA进行Southern杂交分析表明 ,Tn45 6 0至少在 4个不同的位点插入到 71 0 0的染色体上。用实验室已获得的与尼可霉素生物合成有关的 3 0kbDNA片段为探针和经不同酶切的 8株突变株的总DNA进行Southern杂交 ,结果表明 ,除阻断突变株Nik5有杂交信号且杂交信号大小均同野生型 71 0 0外 ,其余 7株突变株均无任何杂交信号。HPLC分析表明 ,8株突变株在产生尼可霉素方面可分为两种类型 ,Nik5为 1种类型 ,其余 7株为另一种类型。初步推测这 7株突变株基因组DNA与尼可霉素生物合成有关的部分发生了大片断的缺失。以Tn45 6 0为探针 ,构建Nik5的部分?

ARTP-DES复合诱变结合前体耐受性选育达托霉素高产菌株

为提高玫瑰孢链霉菌AN-126的达托霉素产量,对菌株AN-126进行常压室温等离子体-硫酸二乙酯(ARTP-DES)复合诱变,并结合癸酸钠耐受性筛选,最终获得一株达托霉素高产菌株RR-447,摇瓶产量为(101.41±0.37)mg/L,是出发菌株的2.44倍。对高产菌株RR-447进行平板传代、菌落形态及BOX-PCR多态性分析。结果表明,高产菌株RR-447高产性能稳定遗传,与出发菌株的菌球形态有明显差异,且高产菌株RR-447基因组DNA在1.50~2.00 kb之间存在一条特异性条带。在5 L发酵罐中通过分阶段补加癸酸钠溶液评价了菌株RR-447的发酵性能,达托霉素产量达到512.64mg/L。ARTP-DES复合诱变结合癸酸钠耐受性是选育达托霉素高产菌株的一种有效育种手段,为达托霉素工业微生物育种以及其他菌株改良提供了技术参考。

黑暗链霉菌安普霉素生物合成基因aprG的克隆和功能研究

从安普霉素产生菌 S.tenebrarius H6总 DNA中已克隆得到 8.2 kb的安普霉素抗性基因连锁片段。对距离抗性基因下游 4 .5 kb的 Sac I- Sau3AI片段进行测序分析 ,发现了一个新的 891bp开放阅读框架。推测其编码为 2 96个氨基酸的蛋白质。经 BL ASTX程序分析 ,没有发现与之同源的基因 ,是一个新基因 ,该基因命名为 apr G。构建基因阻断穿梭载体 p SPU5 8,经接合转移导入 S.tenebrarius H6 ,筛选单交换阻断变株 ,并用Southern blot验证阻断变株的 apr G已经被破坏。经发酵分析 ,阻断变株不再合成安普霉素 ,表明 apr

龟裂链霉菌工业菌中zwf1基因的阻断对土霉素生物合成影响

目的运用代谢工程手段对龟裂链霉菌工业菌(Industrial Streptomyces rimosus,SRI)进行基因改造,提高土霉素(oxytetracycline,OTC)产量。方法利用pKC1139质粒阻断SRI基因组中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)编码基因zwf1。结果筛选得到一株OTC高产突变株,将突变株与原始菌株进行发酵,发现OTC产量比原始菌株提高了36.2%。结论 SRI基因组中zwf1基因的缺失使细胞合成土霉素的能力增强;龟裂链霉菌中初级代谢关键基因调控会影响次级代谢。

林可霉素生物合成基因lmbH的回转化

以ｐＩＪ７０２或ｐＩＪ４８６为载体构建了３个含有ｌｍｂＨ基因的重组质粒ｐＥＳＳ７０１、ｐＥＳＳ７０４和ｐＥＳＳ７０８，分别回转化林可霉素产生菌（Ｓ．ｌｉｎｃｏｌｎｅｎｓｉｓ）Ｂ４８，并随机挑选了６００个回转化克隆进行摇瓶初筛，以抑菌圈直径作为衡量林可霉素产量的标准。结果发现，每一种重组方案均得到了一个产量明显高于产生菌对照的回转化同源整合菌株，即６号（ｐＥＳＥ７０１）、８１号（ｐＥＳＥ７０４）和２４４号（ｐＥＳＥ７０８），折算成效价的提高率分别为７１．９％，１１０．６％和５３．６％。

银杏酸C17:1衍生物增效达托霉素抗粪肠球菌的发现与机制的初步研究

目的发现有抗菌活性或是增效活性的银杏酸C17:1衍生物。方法以银杏酸C17:1为底物,利用一些基团取代苯环上的羧基从而获得银杏酸C17:1衍生物,棋盘法设计试验,测定银杏酸C17:1及其衍生物联合抗生素的增效作用,通过测定Zeta电位、ROS、NPN吸收来探究增效机制。结果银杏酸C17:1衍生物Ⅱ与达托霉素联合抗粪肠球菌的部分抑菌浓度指数(FICIs)为0.125~0.25,具有明显的协同效应,不仅能产生较高的活性氧,而且能在一定程度改变细胞膜的通透性。结论银杏酸衍生物Ⅱ对达托霉素体外抗耐药株具有较好的增效作用,可能和ROS的激增以及膜通透性的改变有关。

庆大霉素生物合成基因genD2的研究

以绛红小单孢菌G1008基因组为模板,PCR扩增genD2的上下游序列作为同源交换臂,在温敏型穿梭质粒pKC1139的基础上,构建同源重组质粒pDB303;通过接合转移,将质粒pDB303导入绛红小单孢菌G1008,经影印筛选得到一株genD2框内缺失的工程菌GD238。发酵并提取代谢产物,质谱分析表明,工程菌GD238只积累庆大霉素A2和A2e,证明genD2参与了庆大霉素加洛糖胺上C-3″位氨甲基化,可能是编码脱氢酶基因。

透明颤菌血红蛋白基因在龟裂链霉菌中的表达及其对土霉素合成的影响

目的考察透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在大肠埃希菌(E.coli)和龟裂链霉菌(S.rimosus)中的表达,研究在不同溶氧条件下表达的透明颤菌血红蛋白(VHb)对龟裂链霉菌生长和土霉素合成的影响。方法将vgb插入表达型质粒pET-28a中,导入E.coli BL21(DE3)用以表达VHb并测定其活性。以整合型质粒pSET152为载体,利用erm E*启动子组成型表达vgb基因,将构建的质粒通过接合转移整合到S.rimosus M4018基因组上,利用CO差示光谱法和SDS-PAGE鉴定两个重组菌中的血红蛋白。在5L罐上考察不同溶氧条件下VHb的表达对重组龟裂链霉菌生长和土霉素合成的影响。结果重组大肠埃希菌和重组龟裂链霉菌都能够表达具有生物活性的VHb,发酵结果表明,在117h时与对照菌相比,重组龟裂链霉菌在高氧和低氧条件下的干重分别提高了6%和32%,同时单位干重土霉素的产量分别提高了41%和93%。结论 VHb在重组龟裂链霉菌中成功表达,改善了菌体的生长和土霉素的合成,为解决工业发酵过程中氧限制问题提供了策略。

庆大霉素生物合成基因genD1的研究

为研究genD1基因功能,在绛红色小单孢菌GK1101(Δgen K)上构建genD1基因缺失工程菌并分析其代谢产物组分变化。首先构建用于genD1基因框内敲除的同源重组质粒pGD14,经接合转移导入绛红色小单孢菌GK1101,经影印筛选获得genD1缺失工程菌GD1989。再发酵并提取其代谢产物,采用质谱法等检测代谢产物。结果表明,工程菌GD1989不再合成庆大霉素C1a和C2b,主要积累庆大霉素A。对工程菌GD1989喂养庆大霉素X2的发酵产物经检测含有庆大霉素C1a、C2b和JI-20A。genD1基因失活导致庆大霉素生物合成代谢流中断,说明genD1基因负责加洛糖胺C-4″位的甲基化。

金霉素生物合成基因ctcK的研究

为检测ctcK基因的功能,利用基因工程技术在金色链霉菌J13(Streptomyces aureofaciens J13)上构建ctcK基因缺失工程菌SK12(ΔctcK),并分析了其次级代谢产物的变化.经质谱分析显示,工程菌SK12代谢物中检测到去甲基金霉素m/z=465.10[M+H]^+的分子离子峰,但未检测到金霉素m/z=479.12[M+H]^+的分子离子峰,这与出发菌J13代谢物的检测结果相反.结果表明,ctcK基因的失活阻断了金霉素的生物合成代谢流,使工程菌SK12主要积累去甲基金霉素,显示ctcK基因参与金霉素C-6位甲基化.本研究初步阐明了ctcK基因的功能,同时获得了一株主产去甲基金霉素的工程菌.