甲磺酸达氟沙星N-脱甲基杂质的合成研究

研究一种制备甲磺酸达氟沙星N-脱甲基杂质标准品的方法。以甲磺酸达氟沙星为起始原料,通过碘氧化实现N-脱甲基反应,随后进行精制和后处理步骤,最终获得含量97.13%(HPLC)的目标杂质标准品N-脱甲基。方法操作简便且产物纯度高,其结构经^(1)H NMR、HRMS等确证。

达氟沙星对施氏鲟的急性毒性及组织残留检测

将施氏鲟(Acipenser scherenscki,体重75-95 g)暂养于室内玻璃水族箱内7 d后进行实验。所用达氟沙星(Danofloxacin)纯度为99。5％。分别以剂量800、1040、1352、1157.60、2284.88和2970.34 mg／(kg体重)对施氏鲟进行口灌,以400、440、484、532.4、585.6和644.2 mg／(kg体重)进行腹腔注射达氟沙星水溶液,给药后连续10 d观察实验鱼的行为及死亡情况。用改进的寇氏法计算得出施氏鲟腹腔注射达氟沙星的LD50为429.47 mg／(kg体重),LD50的95％可信限为425.22-433.66 mg／(kg体重)。口灌达氟沙星LD50为1502.10 mg／(kg体重),95％可信区间范围为1307.89-1738.60 mg／(kg体重)。对染毒死亡鱼及对照组实验鱼分别进行组织切片,并分别进行光镜及电镜观察。光镜观察结果表明,染毒死亡鱼的肝细胞的索状结构消失,肝组织呈弥漫性坏死,肝细胞肿胀,有些肝细胞失去正常的多角形形状,细胞核肿胀变形;窦状隙腔变窄,其中的红细胞形状也不同程度发生了改变。染毒死亡鱼的肝细胞的超微结构显示,肝细胞内充满脂滴,肝细胞核萎缩、消失,线粒体脊断裂,线粒体破裂,粗面内质网结构疏松有断裂,滑面内质网数量明显减少,溶酶体破裂。用高效液相色谱法测定以10 mg／(kg体重)剂量连续4次口灌给药后,达氟沙星在施氏鲟血浆、肝脏、肾脏、肌肉?

QuEChERS-高效液相色谱-荧光法检测鸡蛋中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星和沙拉沙星的残留量

目的建立QuEChERS前处理结合高效液相色谱-荧光检测器(highperformanceliquid chromatography-fluorescence detector, HPLC-FLD)同时检测鸡蛋中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星和沙拉沙星残留量的方法。方法鸡蛋样品添加4.0 g硫酸钠和1.0 g氯化钠,再加入8 mL 1%甲酸乙腈进行提取,离心后上清液再加入到Agilent dSPE净化管中,经浓缩后采用HPLC-FLD进行检测, 0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液(pH2.4)-乙腈为流动相,检测波长:激发波长280nm,发射波长450nm,采用外标法定量。结果环丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星的线性范围为2～100μg/L,相关系数均大于0.9999,达氟沙星的线性范围为0.4～20μg/L,相关系数大于0.9999。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的最低定量限为2μg/kg,达氟沙星的最低定量限为0.4μg/kg。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星在2～10μg/kg的浓度添加水平上,回收率为70.2%～91.8%,达氟沙星在0.4～2μg/kg的浓度添加水平上,回收率为70.5%～96.3%,批内、批间的相对标准偏差分别为3.89%～9.20%、5.29%～12.3%。结论该方法简便、快速、准确、灵敏度高,适用于鸡蛋中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星和沙拉沙星残留量的检测。

达氟沙星对施氏鲟肝脏抗氧化功能和转氨酶活性的影响

分别用20、50、100mg/(kg体重)3个剂量的达氟沙星(Danofloxacin)水溶液连续口灌施氏鲟(Acipenserscherensckii)20d,并于给药后第5、10、15、20天用试剂盒测定肝脏SOD、CAT、GOT和GPT的活性及MDA和NO的含量。施氏鲟体重75～95g。结果表明,短时间内给药后(5天),100mg/(kg体重)组SOD活性与对照组相比提高显著(P<0 01)。随着实验时间的延长(第10、15天),与对照组相比各实验组SOD酶活性均保持在较高活性(P<0 01)。至第20天,各实验组SOD活性呈下降趋势,但仍明显高于对照组。给药后第5天时,各实验组CAT活性与对照组之间无差异;至第10、15天时,50、100mg/(kg体重)组均极显著高于对照组;给药后第20天,仅100mg/(kg体重)组显著低于对照组。实验第5、10、15、20天时,各实验组与对照组之间GPT和GOT活性均没有明显的差异性。仅在相同实验组内随着时间的改变有些变化。与对照组相比,在实验第5、10、15、20天各剂量组MDA含量均无显著的变化。20、50mg/(kg体重)组在第5、10、15天时有所降低,但至第20天时均恢复到对照组的水平;100mg/(kg体重)组至第15天降至最低,但实验结束时反而明显高于对照及其他实验组。从实验结果看,在实验第5、10、15、20天,各实验组施氏鲟肝脏NO含量与对照组相比较没有明显的变化。结果表明。

达氟沙星在健康和鳗弧菌感染牙鲆体内的药物代谢动力学比较

牙鲆随机分为3组,单剂量静注(健康)和口灌(健康对照和鳗弧菌感染)达氟沙星,进行健康和鳗弧菌感染牙鲆比较药动学和生物利用度的研究。药物浓度用高效液相色谱法测定,数据采用MCP-KP自动化药动学分析程序进行分析。结果表明,健康牙鲆静脉注射达氟沙星(5mg.kg-1)后,血药经时过程符合无吸收一室开放模型。口灌给药(10mg.kg-1)健康及感染牙鲆的血药浓度与时间关系均符合一级吸收一室开放模型;肝脏和肾脏中药物浓度与时间关系均符合一级吸收二室开放模型。与健康牙鲆药动学参数相比较,达氟沙星在鳗弧菌感染牙鲆中的药时曲线下面积由256.07mg.h-1.L-1降为209.18mg.h-1.L-1,最大血药浓度由5.699μg.mL-1降低为2.932μg.mL-1,消除半衰期由27.758h延长为46.195h,生物利用度由71.21%降低为58.17%。

甲磺酸达氟沙星在鲫体内药物动力学及残留研究

【目的】研究甲磺酸达氟沙星(Danofloxacinmesylate,DFM)在鲫体内的药物动力学和残留消除规律。【方法】在试验水温20℃时,鲫以10mg·kg-1b.w的剂量单次经口灌服甲磺酸达氟沙星后,用液-液提取、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定血浆和组织中DFM的浓度。盐酸氧氟沙星做为内标。房室模型分析表明,其药物时间数据符合有吸收二室模型,吸收、分布迅速,但消除缓慢,半衰期(T1/2Ka、T1/2α、T1/2β)分别为0.63、4.96、47.79h,最大血药浓度(Cmax)为3.23μg·ml-1,达峰时间(TP)为2.73h,药时曲线下面积(AUC)为154μg·h·ml-1。非房室模型分析表明,平均滞留时间(MeanResidenceTime,MRT)为58.56h。【结果】组织中药物浓度在测定时间里均显著高于血浆(P<s0.05),消除快慢依次为肾脏、肝胰脏、血浆、肌肉和皮肤,其消除半衰期分别为33、44、48、51、177h。与其它组织相比皮肤消除最慢,建议其作为DFM在鲫体内的残留靶组织。在20℃时,皮肤以100μg·kg-1为最高残留限量(maximumresiduelimit,MRL)建议休药期不低于23d。

达氟沙星在史氏鲟体内药物代谢动力学比较研究

采用高效液相色谱法测定以10mg/kg体重剂量静脉注射和口服给药后史氏鲟血浆中达氟沙星的浓度。该法采用C18色谱柱,流动相为乙腈-水相(15∶85),荧光激发波长和发射波长分别为280nm和450nm,样品用甲醇沉淀蛋白,离心取上清液进样。达氟沙星在0.005—1.0μg/mL范围内线性关系良好,本方法的最低检测限为0.005μg/mL。健康鱼单剂量静注达氟沙星(10mg/kg),其药时数据符合无吸收的三室开放模型,方程为C=5.830-5.582t+4.162-1.157t+0.852-0.029t,主要动力学参数如下:t1/2α0.552h;t1/2β22.186h;AUC34.226mg/(L.h);V 10.922L/kg;Vb10.144L/kg;ke 10.317h.Ah感染组的V1减小至0.290L/kg,静注感染组鱼体内达氟沙星的消除没有显著的改变。健康口服组数据结果符合一级吸收二室开放模型,血药浓度和时间方程为C=1.278e-0.073t+0.177e-0.089t-1.455e-0.329t。药动学常数分别为:t1/2ka9.491h,t1/2β78.267h,Tmax6.284h,Cmax0.791mg/mL;α0.073h。但Ah感染改变达氟沙星口服给药后在史氏鲟体内的吸收、分布和消除。分布速率常数降低为0.050/h。消除减慢,消除半哀期延长为93.988h,达峰时间延长为至9.060h,峰浓度降低为0.585mg/mL。口服达氟沙星水溶液,健康及感染组史氏鲟对达氟沙星生物利用度分别为96.503%和94.435%。本实验结果表明达氟沙星在健康史氏鲟体内分布广泛、吸收较完全。感染Ah对达氟沙星在史氏鲟体内的吸收、分布及消除规律均有不同程度的影响,其中口服给药的影响更为显著。达氟沙星可用于史氏鲟感染Ah的治疗。

达氟沙星对感染嗜水气单胞菌史氏鲟的药效学研究

体外抑菌试验测得达氟沙星(Danofloxaxin)对鱼类嗜水气单胞菌的最小抑菌质量浓度(MIC)为0.05 mg/L,最小杀菌质量浓度(MBC)为0.1 mg/L,四种培养条件对其抑菌效果均有不同的影响,其中镁离子和pH对MIC和MBC的影响最为显著,相对细菌接种量和血清浓度对其抑菌活性的影响则较小.体内药效试验表明,达氟沙星以2.5,10,20 mg/kg口灌给药,连续给药4次,人工感染嗜水气单胞菌的史氏鲟的死亡率分别为15％,0,0,氟苯尼考、恩诺沙星和新诺明分别以50,10,100mg/kg给药,感染鱼的死亡率均为0,而感染不给药组(阳性对照组)的史氏鲟的死亡率为45％.达氟沙星组试验鱼肝脏感染率分别为40％,0,0,氟苯尼考、恩诺沙星、新诺组感染率分别为40％,0和60％,而感染不给药组史氏鲟的肝脏感染率为100％.中、高剂量的达氟沙星对感染嗜水气单胞菌的史氏鲟的治疗效果与恩诺沙星(10 mg/kg)相近,而优于氟苯尼考(50 mg/kg)和新诺明(100 mg/kg).

达氟沙星对史氏鲟红细胞抗氧化功能及微核形成的影响

2004年5月至7月间,用20mg.kg-1、50mg.kg-1和100mg.kg-1剂量对史氏鲟经口灌服达氟沙星20d,分别于第5、10、15和20天定红细胞SOD、CAT、Na+、K+-ATP酶、GST、GSH-PX等抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量,以评价达氟沙星对史氏鲟抗氧化防御功能的影响,同时进行红细胞微核率和总核异常率的测定。结果表明实验第5天各实验组红细胞SOD活性均显著高于对照组;各实验组红细胞中CAT的活性明显高于对照组;红细胞Na+、K+-ATP酶活性没有明显的改变。实验第20天时100mg.kg-1剂量组GSH-PX活性明显高于对照组及其他剂量组(P<0.05);GST活性及MDA含量没有明显的影响。达氟沙星在实验剂量内对史氏鲟红细胞核微核率没有明显的影响,但核异常率呈明显升高。

达氟沙星在健康大菱鲆体内的药代动力学研究

在水温16±0.6℃条件下,以20mg/kg鱼体重剂量对健康大菱鲆静脉注射和口服达氟沙星,利用高效液相色谱法测定96h内血浆和组织中的达氟沙星含量。DAS 2.0自动药动学软件分析表明,静注给药时,达氟沙星的血药经时过程符合零级吸收二室开放模型,表达方程式为C静注=45.74le-1.927t+7.332e-0.019t,消除半衰期(t1/2β)和药时曲线下面积(AUC0-t)分别为36.336h和431.981h.μg/ml;口服给药时,达氟沙星的血药经时过程符合一级吸收二室开放模型,表达方程式为C口服=6.796e-0.05t+3.135e-0.005t-9.931e-0.11t,12h时血药浓度达到最大值(Cmax)5.312μg/ml,消除半衰期、药时曲线下面积和表观分布容积(Vd)分别为129.228h、284.915 h.μg/ml和2.986 L/kg;口服达氟沙星的生物利用度(F)为65.96%,肝脏和肾脏内的药物浓度较高,与血药浓度相似,而肌肉内较低。根据达氟沙星在大菱鲆体内的药代动力学特点及其对主要致病菌的体外抑菌参数指标,提出了口服给药方案:按12.17mg/kg体重/次,1日1次。

达氟沙星对试验性感染仔猪副伤寒和霉形体肺炎的药效学研究

研究了国产新兽药达氟沙星对人工感染仔猪副伤寒和霉形体肺炎的疗效。每个疗效试验用仔猪 10 5只 ,随机分为达氟沙星 3个不同剂量组、恩诺沙星对照组、强力霉素对照组、阳性对照组和阴性对照组 ,每组动物15只。当感染猪出现典型症状时 ,达氟沙星 3个剂量组分别按每千克体重 2 .5mg、1.2 5mg、0 .6 2 5mg及恩诺沙星组按 2 .5mg肌肉注射 ,每日 2次 ,强力霉素按每千克体重 3mg肌肉注射 ,每日 1次。结果表明 :达氟沙星 3个不同剂量组、恩诺沙星组、强力霉素组连续用药 4d ,对仔猪副伤寒的治愈率分别是 10 0 %、80 %、33 .3%、80 %、5 3 .3% ,而感染 (阳性 )对照组的死亡率为 6 6 .7% ;达氟沙星 3个不同剂量组、恩诺沙星组、强力霉素组连续用药5d ,对霉形体肺炎的治愈率分别是 10 0 %、80 %、46 .7%、93 .3%、6 0 % ,肺部病变率分别是 2 0 %、40 %、6 0 %、2 0 %、6 0 % ,而感染 (阳性 )对照组的死亡率为 40 % ,肺部病变率为 10 0 %。

达氟沙星(Danofloxacin)在鸡体内的组织残留

建立了鸡组织中达氟沙星 ( Danofloxacin)的高效液相色谱 ( HPL C)测定方法 ,并测定了鸡单次内服 (每千克体重5 m g)给药后组织中的达氟沙星残留特征。组织样品用含 0 .0 15 mol/ L H3PO4 和 0 .0 15 mol/ L HCl O4 的水 -甲醇 ( 5 0∶5 0 )提取 ,5 0℃水浴酸性水解 90 min,离心后取上清液作 HPL C检测。色谱柱为 Hypersil BDS C1 8柱 ;荧光检测器检测 ,激发波长 2 80 nm,发射波长 4 4 0 nm;流动相为含 0 .0 15 m ol/ L 四丁基溴化铵的水 -乙腈 ( 90 5∶ 95 ,组织检测时为 915∶85 )混合物 ,85 %磷酸调 p H为 3.0。血浆、肝脏、肾脏、肺脏、肌肉中达氟沙星的检测限为 0 .0 2 m g/ L或 0 .0 2μg/ g,血浆样品回收率大于 90 % ,组织样品回收率均大于 74 %。鸡单次内服甲磺酸达氟沙星后 ,在 6 0 h内各组织中均可检出药物 ,但在 4 8h所有组织中药物残留量均低于相应的 MRL s(最高残留限量 )。结果表明 。

基于同步荧光光谱的鸡肉中甲磺酸达氟沙星和氧氟沙星残留快速检测方法研究

采用同步荧光技术结合化学计量学方法实现了鸡肉中甲磺酸达氟沙星(DFM)和氧氟沙星(OFL)残留的快速检测。首先,分析了DFM标准溶液、OFL标准溶液、空白鸡肉提取液和含DFM和OFL的鸡肉提取液的同步荧光光谱,确定了鸡肉中DFM和OFL残留的检测波长差(Δλ)分别为130和200nm,荧光激发峰分别为288和325nm。其次,采用单因素试验考察了氢氧化钠溶液浓度和表面活性剂种类对荧光强度的影响,确定了鸡肉中DFM和OFL残留的最佳检测条件为:氢氧化钠溶液浓度0.1mol·L^(-1)和SDS溶液浓度0.1mol·L^(-1)。最后,利用线性回归和偏最小二乘回归(PLSR)及多元线性回归(MLR)算法分别建立了鸡肉中DFM和OFL残留的预测模型。试验结果表明,与基于线性回归和MLR的DFM残留预测模型相比,基于PLSR的DFM残留预测模型的综合评价更好,其预测集决定系数(R2P)为0.9783,预测集均方根误差(RMSEP)为1.9342mg·kg^(-1),相对预测误差(RPD)为5.8765。与基于线性回归和PLSR的OFL残留预测模型相比,基于MLR的OFL残留预测模型的综合评价更好,其R2P为0.8950,RMSEP为3.8598mg·kg^(-1),RPD为2.5091。该方法操作简单、耗时短,可用于鸡肉中DFM和OFL残留的快速检测。

达氟沙星人工抗原的合成与鉴定

采用碳二亚胺偶联法将达氟沙星分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)载体蛋白偶联,制备达氟沙星人工抗原DFLX-BSA和DFLX-OVA,并用FeC l3显色反应、紫外扫描和酶联免疫吸附试验对制备的人工抗原进行鉴定。结果表明:DFLX与BSA和OVA的偶联比为14∶1和16∶1时可成功地制备达氟沙星人工抗原。

达氟沙星抗体的制备

为了制备达氟沙星(DFLX)多克隆抗体,使用合成的DFLX-BSA偶联物免疫獭兔,用ELISA方法检测抗血清效价。结果显示,2只动物中1只产生了高效价的抗血清,另1只产生的效价较低。得出结论,用合成的DFLX-BSA偶联物免疫兔子获得了高效价的抗血清。

达氟沙星单克隆抗体的制备与鉴定

采用碳二亚胺法将达氟沙星与BSA和OVA偶联制成免疫抗原DFLX-BSA、检测抗原DFLX-OVA。采用FeCl3显色反应、紫外扫描分析法对合成的抗原进行了鉴定。用免疫抗原DFLX-BSA腹腔免疫BALB/c小鼠,有限稀释法筛选获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株1株4F9,单抗亚型鉴定为IgG1,并将此细胞株注射小鼠腹腔获得腹水,用辛酸-硫酸铵法对腹水进行了纯化。纯化后的抗体效价为2.48×10-6,紫外分析方法计算蛋白含量为1.348 mg/mL。

达氟沙星对施氏鲟非特异性免疫功能的影响

采用经口灌服的方法,分别用20、50和100 mg.kg-1达氟沙星对施氏鲟连续给药20 d(每天1次),并于给药后第5、10、15和20天测定非特异性免疫指标.结果表明:达氟沙星对肝脏和血清溶菌酶含量有抑制作用;20和50 mg.kg-1组对血清中酚氧化酶活力先诱导后抑制,100 mg.kg-1组则始终表现抑制作用;该药使白细胞数量和细胞吞噬百分比降低,但对白细胞吞噬指数及肝脏和脾脏系数无显著影响(P>0.05).可见,达氟沙星使施氏鲟的非特异性免疫能力降低,但对免疫器官的生长指数没有明显的影响.

达氟沙星间接竞争ELISA检测方法的建立

将达氟沙星（danofloxacin,DFLX）与牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）偶联分别作为免疫原与包被原,达氟沙星为竞争的半抗原,建立间接竞争ELISA检测方法。试验结果表明,理想的包被抗原浓度为1.25μg/L,多抗（DFLX-PcAb）工作浓度为1∶10000,酶标二抗的工作浓度为1∶4000,最适检测范围为0.1~10 ng/L,最低检测限为0.2 ng/L,批内和批间变异系数分别为3.81%和6.25%。得到回归方程y=0.7975-0.125x（R2=0.989）和标准曲线,从而建立了DFLX的快速检测残留的间接竞争酶联免疫吸附试验（ci-ELISA）。

鲫血浆中甲磺酸达氟沙星的RP-HPLC法测定

建立了测定鲫血浆中甲磺酸达氟沙星浓度的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）.采用ZORBAX SB-C18色谱柱和SB-C18的保护柱;流动相：乙腈与磷酸盐缓冲液（含10 mmol·L^-1磷酸二氢钠和15 mmol.L-1四丁基溴化铵,磷酸调节pH4.0）的体积比为8∶92;流速：1.0 mL·min^-1;进样量：10μL;柱温：30℃;检测波长282 nm.内标物为盐酸氧氟沙星.本研究建立的甲磺酸达氟沙星标准曲线在0.05-5.00 mg·L^-1范围内呈良好的线性关系（R=0.999 9）,最低检测限为0.01 mg·L^-1,提取回收率均大于80%,日内及日间相对标准偏差小于11%.

氧化应激介导达氟沙星诱导LLC-PK1细胞周期阻滞

目的探讨达氟沙星诱导LLC-PK1细胞氧化应激后细胞损伤的分子机制。方法不同浓度的达氟沙星处理LLCPK1细胞后,通过WST-1法检测细胞增殖抑制情况,DHE、Amplex Ultra Red法分别检测超氧阴离子自由基(O2·-)、H2O2含量,Rhodamine123法检测线粒体膜电位,流式细胞仪检测分析细胞周期及RT-PCR法检测细胞周期相关基因表达含量的变化。结果达氟沙星呈浓度依赖性的抑制LLC-PK1细胞的增殖、升高细胞内O2·-、H2O2含量、诱导细胞周期阻滞,但线粒体膜电位没有显著性下降。100μmol/L浓度达氟沙星处理LLC-PK1细胞后细胞出现G2期周期阻滞,ROS升高含量在自身抗氧化系统修复范围内,细胞并没有出现明显损伤;而浓度达到400μmol/L时细胞发生氧化应激出现可逆性的G1期细胞阻滞,此时细胞周期素抑制蛋白p53、p21、p27m RNA表达显著升高,LLC-PK1细胞对氧化应激造成的损伤进行修复。结论 400μmol/L浓度范围内的达氟沙星处理LLC-PK1细胞24h所致的氧化应激诱导细胞周期阻滞,细胞损伤在自身修复范围之内并未导致细胞凋亡。