白桦环阿齐醇合成酶(CAS)基因与达玛烯二醇合成酶(DS)基因的双基因RNA干扰载体构建

环阿齐醇合成酶(Cycloartenol synthase,CAS)和达玛烯二醇合成酶(Dammarenediol synthase,DS)为白桦三萜合成过程分支途径关键酶基因,对CAS和DS基因的抑制或沉默将有利于三萜前体-2,3氧化角鲨烯向目标产物白桦脂醇和齐墩果酸合成。利用同源序列PCR方法及pRNAi-GG新型载体,进行DS单基因RNAi及DS与CAS双基因RNAi载体的构建。结果显示,分别克隆获得CAS和DS c DNA序列长度为300和509 bp,Blast同源序列比对与已知日本白桦BPX1和OSCBPD相似度为100%和92%。依据基因RNAi引物设计及pRNAi-GG使用原则,分别将CAS、DS的正向片段和反向片段有序地连接到pRNAi-GG载体PDK内含子两侧,并转化大肠杆菌Trans1-T1中,经PCR及克隆测序验证,获得白桦DS单基因和CAS、DS双基因干扰载体,并通过三亲杂交方法分别获得含有两个RNAi载体的工程农杆菌菌株。该研究为进一步通过基因工程手段阻断白桦三萜分支途径及促进前体物质向目标产物白桦酯醇和齐墩果酸方向合成奠定了基础。

抑制齐墩果烷型人参皂苷合成支路对达玛烷型人参皂苷生产能力的影响

表达反义βAS的5个人参发根系在液体培养条件下生长30天后,齐墩果烷型人参皂苷R0含量比对照实验组均有所降低,幅度分别达13%～40%;达玛烷型人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1含量在5个发根系中均有所增加,其中发根系A19的上述单体皂苷含量总和比对照实验组提高了30%;培养过程中达玛烷型人参皂苷含量呈逐渐增加趋势。5个发根系的βAS酶活性比对照实验组均有所下降,最多下降30%,DAS酶活性被上调,尤其发根系A19的酶活性比对照实验组提高了20%;化学分析结果显示,5个发根系人参皂苷前体物2,3-氧化角鲨烯的含量比对照实验组均有所提高。

珠子参皂苷合成途径3个关键酶基因CAS、DS和β-AS时空表达分析

旨在明确环阿屯醇合成酶(CAS)、达玛烯二醇合成酶(DS)和β-香树酯合成酶(β-AS)基因在珠子参中的时空表达情况及其与总皂苷含量的关系。以珠子参叶、茎、花和根状茎为材料,采用实时荧光定量技术检测了3个酶基因在不同时期的表达情况,并分析了基因表达与总皂苷含量之间的关系。CAS、DS和β-AS均在珠子参地上部分高表达,在根状茎中低表达;5—9月间CAS在根状茎中的表达呈现出"高—低—高"的趋势,而DS和β-AS则表现出相反的趋势;珠子参总皂苷含量变化呈"S"型曲线,其前期含量与DS和β-AS的表达呈正相关关系。推测珠子参皂苷最初和主要的合成部位为叶,根状茎可能是后期部分皂苷合成的场所。

采用巢式PCR-直接测序法分析人参达玛烯二醇合成酶基因单核苷酸多态性

目的建立人参皂苷生物合成通路中的关键酶——人参达玛烯二醇合成酶(DS)基因c DNA序列的单核苷酸多态性(SNP)检测方法,为人参属植物DS基因的SNP研究以及人参类药材的品种鉴定提供参考。方法采集不同产地、不同品种和生长年限的人参样品,提取RNA,逆转录为c DNA。采用巢式PCR进行扩增,根据人参DS基因c DNA保守序列设计1组引物用于第1轮PCR,2组DS基因上下游分段引物用于第2轮PCR,扩增产物直接测序。测序结果经BLAST同源性比较后,采用DNAMAN软件进行多重比对分析,以发掘不同样品间DS基因差异位点作为候选SNP。结果 57份人参样本共获得111个符合测序要求的DS基因上下游分段PCR产物,其中测序成功103个,序列经BLAST判定为人参DS基因,经多重比对,发现6个样品存在7个SNP位点。结论建立了巢式PCR-直接测序法发掘人参DS基因cDNA序列的SNP,方法具有特异性好、操作简单、结果准确等优点。可用于检测人参样品的DS基因是否含有SNP及其类型,这可为人参及其相关药材和产品的质量评价新方法研究提供有价值的遗传研究工具和分子标记资源。

创建酿酒酵母细胞工厂高效生产人参皂苷前体达玛烯二醇Ⅱ

人参皂苷是名贵药材西洋参和人参的主要活性成分,其中达玛烯二醇Ⅱ为人参皂苷类成分生物合成途径中的重要中间体。为构建高产人参皂苷前体达玛烯二醇Ⅱ的细胞工厂,本研究在优化过甲羟戊酸途径(MVA途径)工程菌的基础上,通过基因模块组合优化的方法获得能显著提高三萜前体的功能模块C30-M:分别由丹参法尼基焦磷酸合酶(Sm FPS)和拟南芥鲨烯合酶(At SQS2)组成,其鲨烯的含量能达到67.4 mg·g^(-1),约占细胞干重的6.74%;在进一步工作中,发现来源于拟南芥的2,3-环氧鲨烯合酶(At SQE2)能提高下游中间体羊毛甾醇的产量到47.9 mg·g^(-1),为对照菌含量的22倍;然后,通过调控达玛烯二醇Ⅱ合酶基因的表达和采用反义RNA技术对麦角固醇合成途径中的ERG7基因进行调控及发酵工艺优化等策略,首次将三萜合成通量提高到10 g·L^(-1)级别,创建出产量能达到15 g·L^(-1)达玛烯二醇Ⅱ的高效酵母细胞工厂,为达玛烷型人参皂苷的产业化合成奠定了坚实的基础。

人参达玛烯二醇-Ⅱ合酶在酿酒酵母中的表达、定位及功能研究

为了研究人参达玛烯二醇-Ⅱ合酶(dammarenediol-Ⅱ synthase,DS)在酿酒酵母中的重组表达和定位,本研究克隆了人参中达玛烯二醇-Ⅱ合酶基因ds,并将其与绿色荧光蛋白基因gfp融合,构建了相应的重组表达质粒pESC-HIS-DS和pESC-HIS-DS-GFP,转化酿酒酵母INVSc1,获得了重组菌INVSc1-DS和INVSc1-DS-GFP。通过差速离心法制备重组菌微粒体,荧光显微镜下观察达玛烯二醇-Ⅱ合酶的表达及亚细胞定位,并通过酶促反应对该酶进行了功能鉴定,结果表明,DS为膜结合型蛋白,在体外能催化2,3-氧化鲨烯生成达玛烯二醇-Ⅱ。对重组菌发酵产物进行分析,结果表明,重组菌中产生了达玛烯二醇-Ⅱ,且通过将ds与gfp融合,重组菌中的达玛烯二醇-Ⅱ产量由7.53 mg·g^(-1)提高到12.24 mg·g^(-1),该结果为优化在酿酒酵母中构建的人参皂苷代谢途径提供了新思路。

人参花醇提物中的皂苷类化学成分

目的：研究人参Panax ginseng C.A.Meyer（Araliaceae）花中的皂苷类成分。方法：采用多种色谱技术对人参花的醇提物进行分离纯化,并根据理化性质和波谱学数据对化合物进行结构鉴定。结果：从人参花70%乙醇水溶液提取物中分离得到11个化合物,分别鉴定为人参皂苷Re（1）、20（R）-人参皂苷Rg1（2）、20（S）-人参皂苷Rh1（3）、20（R）-人参皂苷Rh1（4）、人参皂苷Rd（5）、人参皂苷F1（6）、人参皂苷F5（7）、人参皂苷F3（8）、20（S）-原人参三醇（9）、达玛-20（21）,24-二烯-3β,6α,12β-三醇（10）和达玛-（E）-20（22）,24-二烯-3β,6α,12β-三醇（11）。结论：化合物3、9~11为首次从人参花中分离得到。

三七细胞中SS、DS共超表达对皂苷合成的影响

为研究三七细胞中SS、DS共超表达对皂苷合成的影响,构建了三七SS超表达载体,并以已超表达了DS的愈伤组织为侵染材料,借助农杆菌LBA4404将SS导入并整合到三七基因组中,采用QRT-PCR法检测转基因株系中SS、DS的表达水平,香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法检测皂苷含量。结果显示：三株同时转SS、DS细胞系（T-4、T-5、T-9）中,SS的相对表达量分别为仅转DS株系的5.66、7.37、7.46倍;DS的相对表达量分别为仅转DS株系的1.39、2、1.41倍;总皂苷含量为仅转DS株系的1.7倍,普通细胞的2.4倍;5种单体皂苷：R1、Rg1、Re、Rb1、Rd含量总和分别为仅转DS株系的1.33、1.61、1.71倍,普通细胞的5.62、6.81、7.26倍;此外,Re含量出现大幅增加,达到三七药材的5-6倍。表明SS、DS在皂苷生物合成途径中均起正调控作用,双基因共超表达能进一步提高皂苷含量,揭示途径中两个甚至更多基因间可能存在正协同调控效应。

西洋参茎叶总皂苷碱降解成分

目的研究西洋参茎叶总皂苷碱降解成分。方法采用硅胶柱色谱并结合HPLC进行分离纯化,通过波谱分析鉴定化合物的结构。结果从西洋参茎叶总皂苷碱降解产物中分离得到9种成分,分别鉴定为:20(S)-原人参二醇(I),20(S)-达玛-25(26)-烯-3,β12,β20-三醇(II),24(R)-ocotillol(III),20(S)-原人参三醇(IV),20(S)-达玛-25(26)-烯-3,β6,α12,β20-四醇(V),达玛-20(21),24-二烯-3,β12β-二醇(V I),达玛-20(21),24-二烯-3,β6,α12β-三醇(V II),20(S),24(S)-达玛-25(26)-烯-3,β6,α12,β20,24-五醇(V III),20(S)-达玛-23-烯-25-过氧羟基-3,β6α,12,β20-四醇(IX)。结论碱降解20位S构型未改变。V,V II,V III,IX为4个新化合物,并利用2D-NMR技术对新化合物的氢和碳的化学位移进行了归属。其中I对HCT-8人结肠癌细胞具有较强的细胞毒活性。

人参皂苷前体工程酵母的构建

从人参发根中通过RT-PCR扩增了人参达玛烯二醇合成酶基因。并利用这一基因和酵母表达载体pAUR123构建了产达玛烯二醇的转基因酿酒酵母。阳性克隆经短梗霉素A抗性粗筛,并经PCR、SDS-PAGE和TLC验证。研究结果表明,这一酵母能够表达人参达玛烯二醇合成酶,并产生达玛烯二醇。达玛烯二醇合成酶在整个酵母生长期内均有表达。达玛烯二醇合成酶活和达玛烯二醇水平在YDP液体培养基中培养36 h和42 h时达到最高,分别为132U/g干细胞和251μg/L。

新功能人造生物器件的构建及集成/人工细胞的代谢网络改造与系统优化

该研究采用合成生物学的理念和方法,结合代谢工程的手段,理性设计、构建、优化了埃博霉素在天蓝色链霉菌和紫杉醇、达玛烯二醇在酵母中的异源合成模块。在该研究中,建立了高通量萜类合成途径分析平台。通过基因替换、蛋白表达水平微调控对大肠杆菌MEP途径进行改造,从而构建适合IPP和DMAPP生产的底盘细胞。今年主要的工作为构建大片段DNA合成与组装技术平台,完成了体外全合成全长的简适线粒体DNA分子并完成了测序鉴定。分析了细胞代谢与线粒体形态的变化规律,为日后开展简适线粒体DNA导入后细胞代谢变化分析提供了技术基础。

白桦植株中三萜前体及不同三萜分支产物积累特征

目的 以三年生白桦为试材，研究白桦植株中三萜合成前体及其三萜组分积累变化，并对白桦植株中三萜组分积累消长特征进行分析。方法 利用高效液相色谱仪及紫外分光光度计对白桦枝皮和叶进行总三萜、白桦脂醇和黄酮等8种成分检测。结果 白桦植株枝皮和叶中三萜物质各组分积累特征显著不同。在生长季节（5～9月）枝皮中2, 3-氧化角鲨烯、白桦脂酸、白桦脂醇、齐墩果酸、达玛烯二醇、固醇及总三萜积累高峰基本为7～9月，其中2, 3-氧化角鲨烯量较低，最高为0.067 mg/g（7月），白桦脂酸量达8.34 mg/g，而齐墩果酸量高达37.51 mg/g（9月）；达玛烯二醇量最高为14.18 mg/g，总三萜量达168.17 mg/g（7月）。叶中总三萜量为8月份较高，达126.11 mg/g，而2, 3-氧化角鲨烯、白桦脂醇和齐墩果酸量均极低，甚至未能检测到。枝皮和叶片中黄酮积累高峰分别为5月和8月，其中2个月份质量分数分别为53.02 mg/g和58.49 mg/g。消长分析表明，白桦枝皮和叶中三萜组分积累与总三萜积累规律不相吻合，枝皮总三萜、达玛烯二醇、齐墩果酸、白桦脂酸呈S型曲线，白桦脂醇积累呈倒“V”曲线，且黄酮积累与总三萜积累趋势相反。叶中总三萜和黄酮物质积累趋势相近，达玛烯二醇和2, 3-氧化角鲨烯积累趋势相近。结论 明确了三年生白桦枝条和叶片中三萜及黄酮物质积累、分布特征，为白桦枝条皮和叶中三萜资源的挖掘、可持续利用及代谢调控奠定了基础。

窄叶鲜卑花地上部分化学成分及降血脂活性研究

目的研究窄叶鲜卑花Sibiraea angustata地上部分的化学成分及其体外降血脂活性。方法采用硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱、半制备液相色谱等方法进行分离纯化,利用NMR、MS等技术鉴定化合物结构,再通过建立人肝癌HepG2细胞高脂模型测试各化合物调脂活性。结果从窄叶鲜卑花的95%乙醇提取物中分离得到了21个化合物,分别鉴定为藜芦酸甲酯(1)、阿魏酸甲酯(2)、3-羟基-4-甲氧基肉桂酸甲酯(3)、3,4,5-三甲氧基肉桂醇(4)、对羟基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)、藜芦酸葡萄糖苷(6)、aglycone(7)、aruncide A(8)、3-[(2E)-4-hydroxyl-4-methyl-2-pentenyl]furan-5H-2-one(9)、吐叶醇(10)、蚱蜢酮(11)、3,7-dimethyl-3(Z),6-octadien-5-one-1-O-β-D-glucoside(12)、(2R,3S,4S)-4-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)-2-(5-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3-ol(13)、1,2-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,3-propanediol(14)、salicifoneoliganol(15)、herpetriol(16)、达玛烯二醇-II(17)、山楂酸甲酯(18)、麦珠子酸(19)、阿魏酸二十四烷酯(20)、对羟基反式肉桂酸二十四烷基酯(21)。结论化合物1~8、10、11、13~21为首次从鲜卑花属植物中分离得到,化合物7、8、17、18在体外实验中显示出降脂活性。

珠子参叶中1个新的三萜皂苷

目的研究珠子参Panax japonicus var.major叶的化学成分。方法采用硅胶、Sephadex LH-20、ODS柱色谱和半制备型高效液相色谱等方法进行分离纯化,根据理化性质和波谱数据分析鉴定化合物的结构。结果从珠子参中分离并鉴定了3个化合物,分别鉴定为20(21),24-达玛二烯-3β,6α,12β-三醇(1)、20(22)Z,24-达玛二烯-3β,6α,12β-三醇(2)、3-O-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖]-20-O-[-β-D-吡喃木糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖]-23E,25-二烯-20(S)-原人参二醇(3)。结论化合物1和2为首次从该植物中分离得到,化合物3为新化合物,命名为珠子参苷Z。

人参茎叶总皂苷碱水解产物中的新人参皂苷20(R)-人参皂苷Rh(19)

目的研究人参Panax ginseng茎叶总皂苷碱水解产物的化学成分。方法采用硅胶柱色谱及半制备高效液相色谱等方法进行分离、纯化,通过NMR、MS等谱学方法进行化学结构鉴定。结果从人参茎叶总皂苷的碱水解产物中共分离鉴定了30个化合物,报道其中的1个新化合物和27个已知化合物,分别为20（S）-原人参二醇（1）、20（R）-原人参二醇（2）、达玛-20（21）,24-二烯-3β,6α,12β-三醇（3）、达玛-20（22）E,24-二烯-3β,6α,12β-三醇（4）、20（S）-原人参三醇（5）、20（R）-原人参三醇（6）、20（S）-人参皂苷Rh_2（7）、20（R）-人参皂苷Rh_2（8）、人参皂苷Rh_16（9）、异人参皂苷Rh_3（10）、20（S）-达玛-3β,6α,12β,20,25-五醇（11）、20（R）-达玛-3β,6α,12β,20,25-五醇（12）、人参皂苷Rk_3（13）、20（S）-人参皂苷Rh_1（14）、20（R）-人参皂苷Rh_1（15）、人参皂苷F_1（16）、人参皂苷Rh_19（17）、20（R）-人参皂苷Rh_19（18）、达玛-20（22）E-烯-3β,6α,12β,25-四醇（19）、三七皂苷T_2（20）、人参皂苷Rg_6（21）、20（22）E-人参皂苷F_4（22）、人参皂苷Rk_1（23）、20（S）-人参皂苷Rg_3（24）、20（R）-人参皂苷Rg_3（25）、20（S）-人参皂苷Rg_2（26）、20（R）-人参皂苷Rg_2（27）和3β,6α,12β,25-四羟基-达玛-20（22）E-烯-6-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（28）。结论化合物18为1个新的化合物;3、4、11、12和19是稀有达玛烷型三萜;7~10、13~18和20~28是稀有人参皂苷。

The blood-brain barrier permeability of 20(S) and 20(R)-protopanaxatriol epimers and dammar-20(22)E,24-diene-3β,6α,12β-triol in MDCK-pHa MDR cell monolayer model

The blood-brain barrier permeability of 20（S） and 20（R）-protopanaxatriol epimers and dammar-20（22）E,24-diene- 313,6α,12β-triol were investigated using the MDCK-pHaMDR cell monolayer model. The bidirectional permeability tests were carried out, and the apparent permeability coefficients （Papp） were calculated. The two protopanaxatriol epimers showed good permeability with Papp values of-10^-5 cm/s, whereas dammar-20（22）E,24-diene-3β,6α, 12β-triol showed poor permeability with Papp of 〈1 × 10^-7 cm/s. The three compounds showed differences in intracellular accumulations due to their different structures. Inhibition of P-gp with verapamil showed that the transport mechanisms in MDCK-pHaMDR cell monolayer for compounds 1 and 2 epimers were not only simple passive diffusion but also involving an effiux way mediated by P-gp. These findings provided new basis for the further study of compounds 1 and 2 acting on the brain.