人参达玛烯二醇-Ⅱ合酶在酿酒酵母中的表达、定位及功能研究

为了研究人参达玛烯二醇-Ⅱ合酶(dammarenediol-Ⅱ synthase,DS)在酿酒酵母中的重组表达和定位,本研究克隆了人参中达玛烯二醇-Ⅱ合酶基因ds,并将其与绿色荧光蛋白基因gfp融合,构建了相应的重组表达质粒pESC-HIS-DS和pESC-HIS-DS-GFP,转化酿酒酵母INVSc1,获得了重组菌INVSc1-DS和INVSc1-DS-GFP。通过差速离心法制备重组菌微粒体,荧光显微镜下观察达玛烯二醇-Ⅱ合酶的表达及亚细胞定位,并通过酶促反应对该酶进行了功能鉴定,结果表明,DS为膜结合型蛋白,在体外能催化2,3-氧化鲨烯生成达玛烯二醇-Ⅱ。对重组菌发酵产物进行分析,结果表明,重组菌中产生了达玛烯二醇-Ⅱ,且通过将ds与gfp融合,重组菌中的达玛烯二醇-Ⅱ产量由7.53 mg·g^(-1)提高到12.24 mg·g^(-1),该结果为优化在酿酒酵母中构建的人参皂苷代谢途径提供了新思路。

三七细胞中SS、DS共超表达对皂苷合成的影响

为研究三七细胞中SS、DS共超表达对皂苷合成的影响,构建了三七SS超表达载体,并以已超表达了DS的愈伤组织为侵染材料,借助农杆菌LBA4404将SS导入并整合到三七基因组中,采用QRT-PCR法检测转基因株系中SS、DS的表达水平,香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法检测皂苷含量。结果显示：三株同时转SS、DS细胞系（T-4、T-5、T-9）中,SS的相对表达量分别为仅转DS株系的5.66、7.37、7.46倍;DS的相对表达量分别为仅转DS株系的1.39、2、1.41倍;总皂苷含量为仅转DS株系的1.7倍,普通细胞的2.4倍;5种单体皂苷：R1、Rg1、Re、Rb1、Rd含量总和分别为仅转DS株系的1.33、1.61、1.71倍,普通细胞的5.62、6.81、7.26倍;此外,Re含量出现大幅增加,达到三七药材的5-6倍。表明SS、DS在皂苷生物合成途径中均起正调控作用,双基因共超表达能进一步提高皂苷含量,揭示途径中两个甚至更多基因间可能存在正协同调控效应。