人过敏毒素C5a反义cDNA的克隆、表达和拮抗作用

采用引物二聚体配对搭桥法成功扩增了人过敏毒素C5a全长的反义cNDA ,将扩增的反义cNDA克隆到原核表达载体pPROEXTM HTc上 ,与 6×His头形成融合基因 ,转化E .coliDH5α ,30℃下经IPTG诱导 ,该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ,表达量达 10 % ;利用金属螯合亲和层析一步法纯化 ,得到纯度 80 %的融合蛋白 ;烟草蚀刻病毒蛋白酶酶切超滤浓缩后 ,得到高浓度高纯度人过敏毒素C5a反义肽 ,经N端蛋白测序鉴定 ,其氨基酸序列正确 .髓过氧化物酶 (myeloperoxi dase ,MPO)为单核细胞PMN所特有 ,其活性可以间接反映C5a趋化白细胞的能力 ,C5a刺激血管内皮细胞表达胞间粘附分子 (ICAM 1)、血管间粘附分子 (PCAM 1)等 ,后者能增加对PMN的粘附 ,检测MPO活性可间接反映出C5a的功能 .还观察了纯化的C5a反义肽对C5a刺激内皮细胞胞浆[Ca2 + ]浓度变化的影响 .高浓度高纯度的C5a反义肽对C5a过敏毒素存在拮抗作用 ,说明反义肽在补体系统C5a分子中是存在的 .

过敏毒素C5a在痛风性关节炎患者中的表达及意义

目的:探讨C5a在痛风性关节炎患者中的表达及意义。方法:纳入37例痛风性关节炎(GA)及28例膝骨关节炎(OA)患者,收集所有患者的相关临床资料,另纳入30例健康体检者作为正常对照组(HC)。采用ELISA法检测GA组、OA组及HC组血清C5a浓度,GA组、OA组关节液C5a浓度以及尿酸单钠晶体体外诱导健康人血清生成C5a的浓度。结果:血清C5a浓度在GA组明显高于HC组和OA组,GA组关节液中C5a浓度显著高于配对血清中的C5a浓度和OA组关节液中的C5a浓度;血清C5a浓度与患者受累关节的压痛和肿胀程度呈显著正相关,血清C5a浓度与CRP浓度呈正相关,关节液中C5a浓度与关节液白细胞计数呈现显著相关性,关节液中尿酸盐晶体负荷与关节液C5a浓度密切相关;③尿酸单钠晶体以剂量依赖性方式促进C5a生成。结论:尿酸盐晶体可诱发C5a的生成,血清C5a浓度可以作为判断GA炎症程度的指标。

大鼠过敏毒素C5a的纯化与鉴定

过敏毒素C5a是补体活化过程中由补体成份5(C5)产生的一种生物活性肽;在体内外具有多种生物学功能。作为致痉挛原(spasmogen),大鼠C5a是迄今已知的活性最强的生物因子,本文报道从酵母多糖活化的大鼠血清中纯化C5a及C5a des Arg的三步层析法及对所获C5a生物化学性质初步鉴定的结果。

不同血清过敏毒素C5a水平的慢性阻塞性肺疾病稳定期的疗效观察

目的:探讨不同血清过敏毒素C5a水平的慢性阻塞性肺疾病(COPD)稳定期的疗效观察。方法:检测60例COPD稳定期老年患者的血清过敏毒素C5a水平,并分析不同血清C5a水平的COPD患者治疗后的肺功能指标、呼吸困难评分和人均年急性发作次数。结果:COPD患者的C5a水平高于健康对照组(P<0.01);C5a低水平组(<100μg/L)的治疗后的FEV1、FEV1/FVC和FEV1占预计值的比例均高于高水平组(≥100μg/L),呼吸困难指数评分和人均年急性发作次数均低于高水平组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:血清过敏毒素C5a水平可影响COPD稳定期的治疗效果,且低水平组的效果优于高水平。

诱导痰过敏毒素C5a在支气管哮喘中的变化特点研究

目的探讨诱导痰过敏毒素C5a在支气管哮喘中的变化特点及其意义。方法选取2015年1月-12月本院呼吸内科确诊的100例支气管哮喘患者作为研究对象,其中急性发作期患者59例(急性发作期组)、缓解期患者41例(缓解期组),另选取非哮喘自愿者50例作为对照组,检测三组诱导痰中过敏毒素C5a、血清中白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-23受体(IL-23r)的水平,测定三组对象的肺功能指标。结果三组对象诱导痰中过敏毒素C5a、IL-17、IL-18及IL-23r水平比较,急性发作期组、缓解期组和对照组的诱导痰中过敏毒素C5a、IL-17、IL-18及IL-23r水平逐渐降低且组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05);三组对象FEV_1/FVC、FEV_1%pred比较,急性发作期组、缓解期组和对照组的FEV_1/FVC、FEV_1%pred水平逐渐升高,且组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05);哮喘患者诱导痰中IL-17、IL-18及IL-23r水平与过敏毒素C5a呈显著的正相关关系(P<0.05),FEV1%pred与过敏毒素C5a呈显著的负相关关系(P<0.05)。结论过敏毒素C5a与支气管哮喘的发病有关,并且与患者的病情、气道炎症反应有关。

人过敏毒素C5a反义肽与其正义肽的相互作用研究

目的 证实过敏毒素C5a与其反义肽分子间是否确实存在选择性相互识别作用 ,进一步以反义肽分子设计的思路 ,寻找过敏毒素C5a拮抗反义多肽的依据。方法 选择人过敏毒素C5a与其受体 (C5aR)相互作用的两个功能区域 ,按照反义肽分子设计的模型 ,分别设计合成其对应的反义肽 ,并利用生物分子相互作用分析 (BIA)技术 ,对C5a正、反义间相互作用进行分析。结果 在设计合成的 4条反义肽中 ,有一条反义多肽与全长C5a以及其对应的正义肽分子间均存在选择性相互作用 ,其解离平衡常数值分别为 6 .6 2× 10 - 6 M、4 .5 0 8× 10 - 6 M。结论 过敏毒素C5a及其反义肽分子间确实存在选择性相互作用 ,从反义肽的思路寻找C5a生物学效应的拮抗多肽 ,进行新药的设计和开发是可能的。

C5a反义肽对实验性脓毒症小鼠肺损伤的作用研究

目的研究C5 a反义肽(NH2-EARLQRVFLYVNPS-COOH)对盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)致脓毒症小鼠发生肺损伤的保护性作用。方法实验组小鼠CLP后即经尾静脉注射反义肽R4 1、2、4、8 mg/kg,浓度0.5mg/m l),观察不同剂量R4对小鼠96 h生存率的影响,并对肺组织进行病理观察,检测肺髓过氧化物酶(MPO)活性,检测动脉血氧分压、肺湿干比。结果相较于对照组,治疗组小鼠在R4使用浓度2 mg/kg时96 h生存率明显提高(P<0.05),动脉氧分压升高(P<0.01)、MPO和肺湿/干比降低(P<0.01)、病理改变减轻。结论反义肽R4在小鼠体内有良好的拮抗C5 a作用,对脓毒症小鼠肺的急性损伤有保护作用。

C5aR在单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中的表达

目的动态观测单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾组织中补体C5a受体(C5aR)的表达变化,探讨C5aR在肾小管间质纤维化发展中的作用机制。方法将36只雄性SD大鼠随机分为UUO组及假手术(SOR)组,每组18只,UUO组行左侧输尿管梗阻术,SOR组仅游离左侧输尿管不结扎。术后第5、10、15天分别处死每组6只大鼠,取左肾行HE和Masson染色,并用免疫组化ELi Vi-sionTM plus法检测肾组织C5aR的表达。结果UUO组第5天肾小管扩张,小管间质细胞部分变性,梗阻后第10天小管间质细胞可见坏死,间质纤维增多,第15天可见弥漫的肾小管基底膜增厚皱缩,纤维化明显(P<0.05),UUO组间质损伤指数与肾纤维化程度在术后不同时间点显著高于SOR组(P<0.05)。免疫组化结果显示:SOR组大鼠肾组织中仅有少量C5aR表达,UUO组术后第5、10及15天C5aR表达(7.94±2.67,12.39±2.64,13.37±0.98)显著高于SOR组的对应时间点(4.50±2.32,5.69±1.73,4.30±1.45,P<0.05),且术后第10天时明显高于第5天(P<0.05),而从第10天到第15天仅稍有增高(P>0.05)。结论实验大鼠梗阻侧肾组织中C5aR的表达在早期随着梗阻时间延长而上调,晚期则增加缓慢,提示C5aR可能在肾脏局部通过与循环系统中的C5a结合在肾间质纤维化早期起作用。

C5a的结构与功能

C5a是机体补体活化过程中产生的过敏毒素之一,某些疾病过程产生的非补体酶也可以裂解前体分子C5产生C5a。国外多家实验室已分离提纯了多种动物的C5aa 并进行了肽链初级和次级结构分析,证明C5a 分子存在受体识别位点和活化中心两个功能区。现已发现多种细胞具有C5a 受体,且受体—配基结合反应无种属特异性。C5a 在体内的生理作用包括致痉(平滑肌收缩和血管通透性增高)、粒细胞活化及调节机体免疫反应。其在临床损伤性疾病,特别是休克并发症中的作用已引起高度重视,目前已有采用抗C5a 抗体和抑制性药物治疗这些疾病的初步成果。

C5a抑制剂改善烧伤引起的心肌功能障碍

以往研究发现，脓毒症时心肌细胞内的过敏毒素C5a与其受体（C5aR）结合可导致心肌功能障碍。烧伤引起的炎症反应同样会使C5a表达增加。本实验研究了C5a抑制剂对烧伤引起的心肌功能障碍的影响。实验通过复制大鼠标准深度烧伤模型，然后监测左心室压力；并测定离体心肌细胞收缩力。结果显示：烧伤后左心室压力和离体心肌细胞收缩力均显著降低。

补体C5aR受体在UUO大鼠模型肾组织中的表达

目的动态检测单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾组织中补体C5a受体（C5aR）的表达变化，从而探讨其在肾小管间质纤维化发展中的可能作用机制。方法将36只雄性SD大鼠随机分为UUO组及假手术（SOR）组，每组18只，UUO组行左侧输尿管梗阻术，SOR组仅游离左侧输尿管不结扎。术后第5、10、15天分别处死每组中6只大鼠，取左肾行HE和Masson染色，并用免疫组化检测肾组织C5aR的表达，RT-PCR检测C5aR的基因表达情况。结果UUO组第5天肾小管扩张，小管间质细胞部分变性，梗阻后第10天小管间质细胞可见坏死，间质纤维增多，第15天可见弥漫的肾小管基底膜增厚皱缩，纤维化明显，UUO组间质损伤指数与肾纤维化程度在术后不同时间点显著高于SOR组（P〈0．01）。免疫组化结果显示：SOR组大鼠肾组织中仅有少量C5aR表达，UUO组术后第5、10及15天C5aR表达[（7．94±2．67）IOD，（12．39±2．64）IOD，（13．37±0．98）IOD]显著高于对应时间点的SOR组[（4．50±2．32）IOD，（5．69±1．73）IOD，（4．30±1．45）IOD]（P〈0．05，P〈0．01），术后第10天明显高于第5天（P〈0．01），而从第10天到第15天仅稍有增高。C5aRmRNA在UUO组从术后第5天到第10天梗阻侧肾脏C5aRmRNA表达明显增多（0．10±0．02到0．34±0．10），而从第10天到第15天表达未见明显增多，甚至有降低的趋势（第15天为0．32±0．06）。结论实验大鼠梗阻侧肾组织中C5aR的表达在早期随着梗阻时间延长而上调，晚期则增多缓慢，其基因水平表达情况同蛋白基本一致，提示C5aR可能在肾脏局部通过与循环系统中的C5a结合在肾间质纤维化早期起作用。

我国发现人感染H7N9病毒致病新机制

近日，军事医学科学院微生物流行病研究所周育森研究员团队联合该院实验动物中心曾林、基础医学研究所黎燕团队、上海复旦大学姜世勃教授等团队，发现人感染H7N9禽流感病毒一种新的致病机制。该病毒通过感染，可导致人体一类免疫蛋白分子——补体系统的过度激活，从而引发急性肺损伤。他们根据这一发现，采用新的治疗策略即通过一种针对过敏毒素C5a的抗体药物来调节补体的分子表达水平，证实可以大大降低“炎症因子风暴”，显著减轻肺组织病理损伤，从而能够有效治疗病毒感染引起的严重肺炎。

H7N9感染致严重肺炎治疗有新策略 以抗体药物遏制“炎症因子风暴”

我国学者研究发现一种新的人感染H7N9病毒致病机制，即病毒通过感染可导致人体一类免疫蛋白分子——补体系统的过度激活，从而引发急性肺损伤。研究人员进一步发现，采用新的治疗策略，即通过一种针对过敏毒素C5a的抗体药物来调节补体的分子表达水平，可以大大降低“炎症因子风暴”，

技术

人感染H7N9病毒致病新机制被发现 解放军军事医学科学院周育森团队研究发现，人感染H7N9禽流感痫毒可导致人体一类免疫蛋白分于——补体系统的过度激活，从而引发急性肺损伤。他们根据这一发现，采用新的治疗策略即通过一种针对过敏毒素C5a的抗体药物调节补体的分子表达水平，证实可大大降低“炎症因子风暴”，显菩减轻肺组织病理损伤，有效治疗病毒感染所致的严重肺炎。