基于H_(2)O_(2)-丁基玫瑰红B-Fe^(2+)体系的荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶的活性

利用H_(2)O_(2)-Fe^(2+)可以快速使丁基玫瑰红B(BRMB)发生荧光猝灭,而过氧化氢酶(CAT)对该猝灭有抑制效应,提出了基于H_(2)O_(2)-BRMB-Fe^(2+)体系的荧光猝灭法测定血清CAT活性的方法。取血清样品10μL,加入1 mmol·L^(-1)H_(2)O_(2)底液0.50 mL,于30℃恒温反应15 min,再依次加入0.02 mmol·L^(-1)BRMB溶液0.70 mL、0.1 mol·L^(-1)冰乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.2)1.00 mL和0.01 mol·L^(-1)Fe^(2+)溶液0.08 mL,于室温反应20 min后用水定容至10 mL,测定体系在590 nm发射波长处的荧光强度F;以煮死酶液为对照,按照同样的方法测定其在590 nm发射波长处的荧光强度F0。结果表明:CAT活性在0.005~0.05 U·mL^(-1)内与体系荧光强度差值F-F0呈线性关系,检出限(3s/k)为1.2×10^(-3)U·mL^(-1);方法用于6份不同年龄健康人群血清CAT活性分析,测定值为31.50~72.30 U·mL^(-1),与碘量法基本一致,CAT活性的加标回收率为95.2%~102%,测定值的相对标准偏差(n=6)为1.7%~3.3%。

过氧化氢酶对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜内细胞因子表达和NF-κB激活的影响

目的观察过氧化氢酶(CAT)对大鼠溃疡性结肠炎(UC)的预防作用。方法用5%葡聚糖硫酸钠(DSS)制备大鼠UC模型;CAT灌肠,观察UC的症状和组织学变化;采用RT-PCR技术检测UC大鼠肠黏膜内TNF-α、IL-1β、IL-8的表达水平;应用免疫电泳迁移率改变分析(EMSA)法检测UC大鼠肠黏膜细胞NF-κB的激活情况。结果CAT预防组UC的症状、组织损害均较CAT治疗组、模型组明显减轻,同时TNF-α、IL-1β、IL-8的表达较CAT治疗组、模型组降低(P<0·05),NF-κB的核结合活性也降低,但较正常对照组仍明显升高。结论CAT对UC的发生有预防作用。

过氧化氢酶和尿素酶B亚单位二价疫苗预防小鼠幽门螺杆菌感染

目的利用人类幽门螺杆菌(H.pylori)感染的小鼠模型研究过氧化氢酶和尿素酶B亚单位二价疫苗预防H.pylori感染的作用。方法把实验动物无特定致病菌C57BL/6小鼠分成7组,分别通过灌胃方法给予过氧化氢酶和尿素酶B亚单位(各100μg)加霍乱毒素(CT)(2μg)、过氧化氢酶(100μg)加CT(2μg)、尿素酶B亚单位(100μg)加CT(2μg)、PBS、单纯过氧化氢酶(100μg)、单纯尿素酶B亚单位(100μg)、单纯CT(2μg),共4次。2周后再用活H.pylori灌胃,再4周后处死动物,取胃粘膜行半定量细菌培养检查H.pylori情况。结果实验各组H.pylori完全保护率分别为:过氧化氢酶和尿素酶B亚单位加CT组83.3%(20/24)、过氧化氢酶加CT组41.7%(10/24)、尿素酶B亚单位加CT组54.2%(13/24);生理盐水组、单纯过氧化氢酶、单纯尿素酶B亚单位、单纯CT组根除率均为0%。未完全保护的小鼠,疫苗组H.pylori的定植密度明显低于其它4组(P<0.05)。此外,二价疫苗组的H.pylori完全保护率及定植密度较单价疫苗组均有显著性差异(P<0.05)。结论由过氧化氢酶和尿素酶B亚单位加免疫佐剂组成的二价口服疫苗较单价口服疫苗有更好的免疫预防效果。

分散红3B及其代谢产物对土壤过氧化氢酶活性的影响

采用室内试验方法研究了分散红3B及其代谢产物对土壤过氧化氢酶活性的影响。结果表明,分散红3B浓度不同对土壤过氧化氢酶活性的影响也不同,浓度越高影响越强。在浓度为1、10、40、80μg.g-1时,其影响过程为先激活、后恢复稳定,在试验初期,浓度越低激活作用越强,随着时间的推移,各浓度均达到最大激活作用,且浓度越高激活作用越强。分散红3B的光解产物对土壤过氧化氢酶活性的影响要大于分散红3B原药,随着光照时间的延长,分散红3B光解产物对土壤过氧化氢酶活性的影响减弱,即对供试土壤生态环境影响减弱。

罗丹明B荧光猝灭法测定过氧化氢酶活性

构建罗丹明B(RB)荧光猝灭法测定过氧化氢酶(CAT)活性新方法。研究表明,在酸性条件下碘离子与过氧化氢反应生成碘,碘与罗丹明B反应导致其荧光猝灭,过氧化氢酶加入前后荧光强度变化量体现了酶的活性,由此建立了一种简便的过氧化氢酶活性荧光分析方法。加酶前后罗丹明B荧光猝灭值与0.15~9U·L^-1活度范围内的过氧化氢酶呈良好的线性关系,检测限达到0.005U·L^-1。方法用于鱼肝提取液CAT分析,结果令人满意。

过氧化氢酶对SW480细胞线粒体和凋亡的影响

目的观察过氧化氢酶(CAT)对SW480细胞线粒体形态、细胞凋亡的影响及细胞内核转录因子(NF)κB表达的变化。方法用脂多糖(LPS)刺激SW-480细胞,再用过氧化氢酶预孵育和治疗;应用透射电镜观察各组细胞内线粒体形态和细胞凋亡的变化;采用免疫组织化学方法检测细胞内NF-κB的表达水平。结果经过过氧化氢酶预孵后,细胞凋亡明显减少,线粒体损伤减轻,同时NF-κB的表达较LPS组和治疗组明显降低(P<0.01),但较正常对照组仍明显增加。结论CAT对SW480细胞的致炎因子刺激后的应激反应有保护作用,能减少细胞的凋亡和线粒体的损伤,这一作用可能与NF-κB的激活有关。

复方丹参滴丸对过氧化氢损伤的人脐静脉血管内皮细胞的保护作用

目的:观察复方丹参滴丸对过氧化氢(H2O2)损伤人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用,探讨其在心脑血管疾病治疗中的机制。方法:用0.1 mmol/L H2O2制造HUVEC损伤模型;按分组把不同浓度的丹参滴丸(0.5g/L0、.25 g/L、0.1 g/L)分别于损伤前、损伤后加入,分别测定细胞活力(MTT法)观察滴丸对H2O2损伤内皮细胞活性的影响;硫代巴比妥酸法测定细胞内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量;硝酸酶还原法测定细胞培养液中一氧化氮含量;免疫细胞化学法观察滴丸对H2O2损伤的内皮细胞NOS2、NOS3(一氧化氮合酶2、3)、NF-κB(核因子кB)表达的影响;同时进行形态学观察。结果:0.1 mmol/L H2O2对HUVEC有损伤作用。H2O2损伤后,滴丸能显著增加细胞活性;显著抑制H2O2诱导HUVEC MDA的产生;双向调节NO产生;影响H2O2损伤后细胞NOS3、NF-κB的表达。结论:损伤前给滴丸浓度0.5 g/L、0.25 g/L、0.1 g/L对H2O2所致内皮细胞损伤有明显拮抗作用。损伤后给药滴丸浓度0.5g/L0、.25 g/L、0.1 g/L对H2O2所致人血管内皮细胞损伤有明显拮抗作用,其作用机制与抗氧化作用及调节NOS2、NOS3、NF-κB的表达有关。

重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位和过氧化氢酶疫苗治疗幽门螺杆菌感染的实验研究

目的 利用人类幽门螺杆菌 (Hp)感染的小鼠模型研究重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位和过氧化氢酶疫苗在治疗Hp感染中的作用。 方法 将 30只二级C5 7BL/ 6小鼠随机分成 3组 ,通过灌胃方法每只小鼠均用活力良好的Hp菌株隔日攻击 2次。在第二次Hp攻击后 4周 ,分别给予重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位疫苗 (A组 )、过氧化氢酶疫苗 (B组 )和生理盐水 (C组 )灌胃 1次 ,4周后处死动物 ,取胃组织分别行尿素酶试验、改良Giemsa染色及定量细菌培养 ,观察Hp定植情况。行HE染色观察胃黏膜组织炎症情况。取脾组织行淋巴细胞增殖试验。结果 C组小鼠Hp定植密度为 1.92× 10 6CFU/g胃组织 ,A组和B组小鼠分别为 1.5 8× 10 5CFU/g和 4 .88× 10 5CFU/g胃组织 ,两个治疗组的定植密度明显降低 (P <0 .0 5 )。治疗组与对照组胃黏膜均无明显炎症反应。治疗组脾淋巴细胞增殖试验阳性。结论 重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位疫苗和过氧化氢酶疫苗对Hp感染有治疗作用。

Exendin-4体外通过抑制NF-κB-iNOS-NO信号减轻氧化应激诱导的小鼠MIN6胰岛β细胞凋亡

探讨胰高血糖素样肽-1受体激动剂Exendin-4(Ex-4)在氧化损伤诱导胰岛β细胞凋亡中的保护作用。培养的MIN6胰岛β细胞,通过AO-EB染色观察细胞凋亡形态,Annexin-V-PI染色流式技术测定凋亡率,Griess法检测细胞内一氧化氮水平,Western blotting检测胞浆iNOS蛋白、胞浆及胞核核因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白表达水平。Ex-4可抑制叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的β细胞凋亡,Ex-4(100 nmol.L-1)预处理较单独t-BHP处理,其凋亡率减少约67%(P<0.001)。Ex-4同时减少NO水平的增高,并抑制t-BHP诱导的β细胞NF-κBp65活化及iNOS蛋白表达水平。Ex-4可能通过抑制细胞内NF-κB活化、胞浆iNOS表达来抑制NO水平,最终减轻氧化损伤诱导的β细胞凋亡。

核糖核酸酶抑制因子对H_2O_2所致的细胞过氧化损伤的保护作用

背景与目的:核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)是广泛存在于哺乳动物细胞质中的一种酸性糖蛋白,根据RI分子组成富含巯基的特点,研究其对过氧化氢(H2O2)损伤的小鼠黑色素瘤B16细胞的影响。 材料与方法:用不同浓度的H2O2分别作用于B16细胞及转染有RI cDNA并且RI过表达的B16细胞,对比损伤前后两者的细胞存活率、LDH漏出量和细胞内MDA含量差别、以及细胞内抗氧化酶类GSHPx、SOD、cAT、XOD活性的差别。结果:与B16细胞相比,RI过表达的B16细胞在H2O2作用下存活率高,LDH漏出量、MDA含量明显减少,细胞内GSHPx、SOD、CAT活性下降幅度减小。结论:RI具有抗氧化功能,能够减轻H2O2所致的细胞过氧化损伤。

幽门螺杆菌过氧化氢酶对SW480细胞中NF-κB和ERK通路的影响

目的观察重组幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)过氧化氢酶(catalase,CAT)对SW480细胞内核转录因子(nuclear factor,NF)κB和细胞外信号调节激酶(extrocellular-signal regulated pro- tein kinase,ERK)通路的影响。方法用脂多糖(LPS)刺激SW480细胞,再用CAT预孵育和处理;采用免疫组织化学方法检测细胞内NF-κB的表达水平,应用Western blot方法检测细胞质内IκB的蛋白表达量,电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)观察NF-κB的激活;应用激光共聚焦显微镜和Western blot方法观察ERK的核内外易位及磷酸化。结果重组Hp CAT与商品化CAT的作用相同,预孵后,NF-κB的表达和激活较LPS组和处理组明显减少,ERK核内易位和磷酸化亦明显减少,但较正常对照组仍明显增加。结论Hp CAT能够抑制NF-κB和ERK通路。

氧化应激对内皮细胞NF-κB、iNOS和NO信号表达的影响

目的观察氧化剂第三丁基过氧化氢(t-BHP)对体外培养的内皮细胞存活率及核转录因子κB(NF-κB)、iNOS和一氧化氮(NO)的影响。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),用不同浓度的t-BHP处理,具体如下:(1)检测细胞存活率。t-BHP作用浓度分别为12.5,25,50,100μmol/L,作用时间分别为30,60,90,120 min,采用MTT法观察;(2)检测NF-κB p65、iNOS蛋白表达量及细胞内NO水平。t-BHP的作用浓度为50μmol/L,作用时间分别为30,60,90,120 min,采用Western blot测NF-κB p65、iNOS蛋白表达量,Griess化学显色法测细胞内NO水平;(3)iNOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME,600μmol/L)预处理内皮细胞24 h,用Griess化学显色法检测细胞内NO水平。结果 t-BHP可降低内皮细胞的存活率,且呈时间及剂量依赖性,50μmol/Lt-BHP作用30 min细胞核NF-κB活化片段p65蛋白表达达高峰,作用60 min细胞质iNOS蛋白达高峰;iNOS抑制剂L-NAME可明显抑制内皮细胞NO升高。结论氧化应激可引起内皮细胞损伤,其效应可能通过NF-κB-iNOS-NO途径介导。

水稻OsCatB敲除突变体的构建及耐逆性初步分析

水稻过氧化氢酶B (catalase B, CatB)主要在非光合组织、愈伤组织、根和种子中表达,参与调控活性氧动态水平的平衡和根系的生长。目前, CatB参与非生物胁迫响应的功能在很大程度上是未知的。本研究利用基因编辑技术CRISPR/Cas9获得OsCatB基因敲除的纯合突变体catb,并分析了catb在盐、高温和氧化等胁迫处理下的生理和生化表型。研究结果发现,在盐处理下,突变体catb的生理和生化表型与野生型植株无显著差异;在热胁迫下, catb的过氧化氢酶活性和存活率与野生型植株相比显著降低,而H2O2含量显著升高;在氧化胁迫下, catb的幼苗高度低于野生型。这些结果说明,水稻CatB参与盐胁迫响应的调控不明显,而主要参与了高温和氧化胁迫响应,并正调控水稻的高温和氧化胁迫耐受性。该研究为进一步探究Os CatB参与逆境响应的分子机制和培育抗逆水稻品种提供了一定的理论指导和遗传材料。

过氧化氢酶活性检测罗丹明B褪色光度法的建立

目的 建立检测过氧化氢酶活力的罗丹明B褪色光度法。方法 在硫酸介质中,加入过氧化氢氧化罗丹明B褪色,再加入Fe^3+加速反应进程,根据酶促反应前后吸光度变化值△A确定过氧化氢酶活性。对建立的方法中的罗丹明B褪色反应条件(褪色反应催化剂、罗丹明B用量、褪色反应时间、褪色反应温度、硫酸用量)及酶促反应条件(过氧化氢体积、酶促反应时间)进行优化;确定该方法的线性范围;加入浓度小于过氧化氢基底液1/2的共存还原性物质(葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖)进行干扰试验。用建立的方法检测鱼肝脏中过氧化氢酶活性。结果 以1 mL Fe^3+作为催化剂,5 mL罗丹明B作为底液时,体系吸光度控制在0.8以内;在2 mmol/L硫酸介质中,40℃条件下反应60 min,罗丹明B褪色程度趋于最大;取过氧化氢基质液1.00 mL,在15 min内,酶促反应达到完全。在最佳条件下,过氧化氢酶活性在0.02~0.3 U/mL范围内与△A具有良好的线性关系,r=0.999 2,检测限为0.011 U/mL。建立的方法可检测鱼肝脏中过氧化氢酶活性。结论 建立的罗丹明B褪色光度法具有较好的选择性和较高的灵敏度,仪器设备简单,操作简便,适用于生物样品微量过氧化氢酶活性分析。

高压氧联合维生素C治疗急性一氧化碳中毒患者的临床分析

目的探讨高压氧联合维生素C治疗急性一氧化碳中毒(ACOP)患者的临床疗效及其对心肌标志物、抗氧化水平的影响。方法按随机数字表法将46例ACOP患者分为2组,每组23例。对照组予以高压氧治疗,观察组在对照组基础上增加维生素C治疗。观察2组治疗总有效率,治疗前后肌酸激酶同工酶(CK-MB)、脑钠肽(BNP)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平,治疗前后过氧化氢酶(CAT)及血清脂质过氧化物(LPO)水平。结果观察组治疗总有效率为95.65%,显著高于对照组的73.91%(P<0.05);观察组治疗后CK-MB、BNP及cTnI水平均显著低于对照组(P<0.05);观察组治疗后CAT及LPO水平均显著低于对照组(P<0.05)。结论高压氧联合维生素C治疗ACOP患者可以提高疗效,减少自由基,缩短住院时间。

UV-B对拟南芥叶片不同来源H2O2的活化和气孔关闭的诱导(英文)

在UV-B调控植物许多生理过程中过氧化氢(H2O2)作为第二信使发挥着重要作用,但H2O2来源途径并不清楚。该研究借助气孔开度分析和激光扫描共聚焦显微镜技术,探讨H2O2在介导不同剂量UV-B诱导拟南芥叶片气孔关闭过程中的酶学来源途径。结果发现:0.5W.m-2 UV-B能诱导野生型拟南芥叶片保卫细胞的H2O2产生和气孔关闭,且该效应能被NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘(DPI)抑制,而不能被细胞壁过氧化物酶抑制剂水杨基氧肟酸(SHAM)抑制,同时该剂量UV-B也不能诱导NADPH氧化酶功能缺失单突变体AtrbohD和AtrbohF以及双突变体AtrbohD/F保卫细胞的H2O2产生和气孔关闭;相反,0.65 W.m-2 UV-B既能诱导野生型也能诱导NADPH氧化酶突变体保卫细胞的H2O2产生和气孔关闭,且该效应能被SHAM抑制,却不能被DPI抑制。结果表明,不同剂量UV-B通过活化不同生成途径的H2O2来诱导拟南芥叶片气孔关闭,即低剂量UV-B主要诱导NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF途径来源的H2O2生成,而高剂量UV-B主要活化细胞壁过氧化酶途径来源的H2O2。

体外培养中硒对黄曲霉毒素B_1损伤凡纳滨对虾肝胰腺细胞的影响

本试验旨在研究体外培养中硒（Se）对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）肝胰腺细胞抗氧化能力的影响以及对黄曲霉毒素B1（AFB1）毒性的缓解作用。在体外培养肝胰腺细胞的基础上,设定含不同浓度（0、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75μg/m L）Se的培养液,研究Se对肝胰腺细胞抗氧化能力的影响;另用浓度为1 600μg/L的AFB1侵染细胞,探究Se对AFB1毒性的缓解作用。结果表明：当Se浓度处于0-0.45μg/m L时,随着Se浓度的增加,丙二醛（MDA）含量呈现降低趋势,但各个浓度之间并没有显著差异（P〉0.05）,过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力随着Se浓度的增加而增强,Se浓度为0.45μg/m L时GSH-Px活力显著高于其他浓度（除0.30μg/m L）时（P〈0.05）;当Se浓度处于0.45-0.75μg/m L时,随着MDA含量升高的同时CAT、GSH-Px活力下降。当细胞受到浓度为1 600μg/L的AFB1侵染后,随着培养时间的增加,MDA含量表现一直升高的趋势,同时CAT、GSH-Px活力都有一定程度的下降;当细胞受到浓度为1 600μg/L的AFB1和浓度为0.45μg/m L的Se共同作用后,随着培养时间的增加,MDA含量有一定程度的改善,CAT、GSH-Px活力得到一定程度的恢复。由此可见,在体外培养条件下,浓度为0.45μg/m L的Se有利于提高凡纳滨对虾肝胰腺细胞的抗氧化能力,且在一定程度上能缓解AFB1对肝胰腺细胞的毒性作用。

丹参多酚酸盐对H_(2)O_(2)所致心肌细胞氧化应激损伤及PPARγ/Nrf2/HO-1通路的影响

目的探讨丹参多酚酸盐(SAL)对过氧化氢(H_(2)O_(2))所致H9c2心肌细胞氧化应激损伤的影响及过氧化物酶体增殖子活化受体(PPARγ)/核转录因子E2相关因子2(Nrf2)/抗血红素加氧酶-1(HO-1)通路在其中的调控作用。方法以100μmol/L的H_(2)O_(2)干预对数生长期H9c2细胞4 h建立心肌细胞氧化损伤模型,设置H_(2)O_(2)组、SAL 50 mg/L组、SAL 100 mg/L组、SAL 200 mg/L组;另取对数生长期H9c2细胞作为正常组。药物干预24 h后,四唑盐(MTT)法和Annexin V-FITC/PI双染法分别检测细胞增殖和凋亡率,2,7-双乙酸二氯荧光(DCFH-DA)探针检测细胞活性氧(ROS)含量,生化分析法检测肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)漏出量,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化法、钼酸铵法分别检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测PPARγ、Nrf2、HO-1、核转录因子-κB(NF-κB)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果与H_(2)O_(2)组比较,SAL 50 mg/L组、SAL 100 mg/L组、SAL 200 mg/L组细胞增殖率升高且凋亡率降低,ROS含量和CK-MB、LDH漏出量降低,MDA含量降低且SOD、CAT活性升高,PPARγ、Nrf2、HO-1蛋白表达上调且NF-κB、Cleaved Caspase-3表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论SAL对H_(2)O_(2)所致H9c2心肌细胞氧化应激损伤具有保护作用,其作用机制可能与激活PPARγ/Nrf2/HO-1通路有关。

PC12细胞转染人GPx-1基因后的抗氧化损伤作用

目的探讨GPx-1高表达在H2O2介导的PC12细胞损伤时的保护作用及分子机制。方法将PC12细胞转染含人GPx-1基因的plncx质粒及空载体plncx质粒,经持续筛选建立起稳定表达人GPx-1基因和空质粒plncx的PC12细胞系。对PC12、GPx-1-PC12、plncx-PC12 3组细胞,分别给予H2O2和亚硒酸钠+H2O2干预方式,GPx活性检测试剂盒检测各组细胞GPx活性;MTT法检测细胞的存活情况;流式细胞仪检测细胞凋亡发生的情况;免疫细胞化学法观察NF-κBp65的表达情况。结果 GPx-1-PC12组细胞GPx活性较对照组明显增高;3组细胞分别给予2种干预后,PC12与plncx-PC12组细胞存活率比较,差异无统计学意义(P>0.05),GPx-1-PC12较PC12、plncx-PC12组细胞存活率明显增高(P<0.01);GPx-1-PC12较PC12、plncx-PC12细胞早期和晚期凋亡率明显下降,存在统计学差异(P<0.01);GPx-1-PC12较PC12细胞NF-κBp65表达明显减少(P<0.01)。结论 GPx-1基因高表达对H2O2所致的PC12细胞氧化损伤有很好的保护作用;GPx-1可抑制PC12细胞氧化损伤时凋亡的发生及NF-κB的表达。