M16添加硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ无法克服昆明小鼠早胚体外发育2-细胞阻滞

目的观察硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(Peroxiredoxin Ⅱ,PrxII)是否可以克服昆明(Kunming)小鼠早胚体外发育2-细胞阻滞。方法取昆明小鼠1-细胞胚置于含PrxII蛋白的M16培养液中培养,观察PrxII对昆明小鼠早胚发育潜能和2-细胞胚内活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平的影响;同时比较昆明和B6C3F1小鼠1-细胞胚在M16中各自的发育情况;激光扫描共聚焦显微镜分别检测比较昆明与B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平以及昆明小鼠体外培养与体内发育2-细胞胚内ROS水平。结果M16培养液中添加PrxII蛋白(1nmol/L和100nMol/L)可以明显降低昆明小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平(P<0.05),但不能克服昆明小鼠体外发育2-细胞阻滞;昆明小鼠1-细胞胚在M16中培养存在2-细胞阻滞现象,而B6C3F1小鼠无2-细胞阻滞现象;昆明小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平显著低于体内发育2-细胞胚(P<0.05),亦略低于B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平(P>0.05)。结论M16培养液中添加PrxII可以明显降低2-细胞胚内ROS水平,但并不能克服2-细胞阻滞。与昆明小鼠体内发育2-细胞和B6C3F1体外发育2-细胞胚相比,体外培养昆明小鼠2-细胞胚内ROS水平并不升高,这些结果提示昆明小鼠体外培养出现2-细胞阻滞的原因并非是胚内ROS水平升高引起。

过氧化物酶Ⅱ对体外培养人退变腰椎间盘髓核细胞的抑制作用

背景:椎间盘退变可导致髓核细胞数量的减少,过氧化物酶Ⅱ可参与细胞的抗氧化损伤、细胞分裂、分化、信号转导和凋亡等过程的调控。过氧化物酶Ⅱ对椎间盘退变有促进作用,但其机制仍不清楚。目的:观察过氧化物酶Ⅱ对体外培养的人退变腰椎间盘髓核细胞的活性和Ⅱ型胶原合成的影响。方法:体外培养人退变腰椎间盘髓核细胞,设置对照组及过氧化物酶Ⅱ10,100和1000ng/L组。对照组不含氧化物酶Ⅱ,其他3组加入相应剂量的氧化物酶Ⅱ。应用免疫组化法鉴定髓核细胞,并采用cck-8试剂盒检测细胞增殖情况,于加过氧化物酶Ⅱ后第3和7天分别取对照组及各组细胞上清液,采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验测定Ⅱ型胶原表达情况。结果与结论:在体外培养的人退变腰椎间盘髓核细胞,随加入的过氧化物酶Ⅱ质量浓度的增加,椎间盘髓核细胞数量和Ⅱ型胶原合成逐渐减少(P<0.01)。提示过氧化物酶Ⅱ对椎间盘髓核细胞的数量和Ⅱ型胶原合成有明显的抑制作用,并呈剂量依赖关系。以此推测过氧化物酶Ⅱ对髓核细胞的抑制作用可能是导致椎间盘退变的一种促发因素。

硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ诱饵质粒的构建和检测

目的构建硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(PrxⅡ)诱饵质粒,同时检测其在酵母菌内的表达和对酵母细胞的毒性。方法提取人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞的RNA,利用RT-PCR获得其cDNA,PCR方法扩增PrxⅡ基因片段,纯化后以内切酶双酶切PrxⅡ和酵母表达载体pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为pGBKT7-PrxⅡ,将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用。结果构建的诱饵载体pGBKT7-PrxⅡ测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确。将pGBKT7-PrxⅡ成功转化入酵母感受态AH109,并证明PrxⅡ蛋白对酵母无毒性作用。结论证实了PrxⅡ蛋白无酵母毒性,诱饵质粒pGBKT7-PrxⅡ可以用于酵母双杂交研究前列腺癌发病机制。

过氧化物酶Ⅱ在心肌缺血／再灌注损伤中的保护作用

背景过氧化物酶（peroxiredoxins，Prxs）在氧化应激反应中具有重要的保护作用。近年来研究发现，过氧化物酶Ⅱ（PrxⅡ）在心肌缺血，再灌注中变化显著，上调PrxⅡ表达对氧化应激损伤具有显著的保护作用，其作用机制有待澄清。目的总结PrxⅡ在氧化应激损伤中保护作用的调控机制，为改善缺血，再灌注损伤（ischemia／repeffusion injury，I／R1）的疗效提供新的思路。内容就PrxⅡ在心肌保护中的作用及研究进展做简要的综述。趋向PrxⅡ可能会成为氧化应激损伤中保护心脏的潜在靶点。

丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注损伤大鼠P-选择素和细胞间黏附分子-1表达及髓过氧化物酶活性的影响

目的探讨丹参酮ⅡA(TanⅡA)对缺血再灌注损伤大鼠P-选择素和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达及髓过氧化物酶(MPO)活性的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、TanⅡA低剂量治疗组和TanⅡA高剂量治疗组,线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。TanⅡA治疗组于术前连续灌胃给药3d,每日1次。用免疫组化法观察缺血90min再灌注24h大鼠额顶部皮质P-选择素和ICAM-1表达,进行MPO活性检测,进行2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色观察脑梗死体积。结果脑缺血90min再灌注24h,缺血再灌注组P-选择素和ICAM-1表达明显增加,与假手术组差异显著;与缺血再灌注组比较,TanⅡA高、低剂量治疗组均显著减少P-选择素和ICAM-1表达,高、低剂量组之间差异亦显著。脑缺血90min再灌注24h,缺血再灌注组MPO活性明显增加,与假手术组差异显著;与缺血再灌注组比较,TanⅡA高、低剂量治疗组均显著减少MPO活性,高、低剂量组之间差异亦显著。TanⅡA治疗组脑梗死体积较缺血再灌注组减小,高、低剂量组之间差异亦显著。结论TanⅡA对缺血再灌注脑损伤具有保护作用,其机制可能与减轻脑缺血再灌注损伤阶段P-选择素和ICAM-1所介导的中性粒细胞浸润的炎症级联反应有关。

Prx Ⅱ基因对小鼠毛囊发育的影响

为了比较野生型与过氧化物酶Ⅱ（PrxⅡ）基因敲除型小鼠毛囊发育的差异,探究PrxⅡ基因对小鼠毛囊发育的影响,试验采用石蜡切片及苏木精-伊红（H.E.）染色的方法,在毛囊不同发育时期（胚胎期第16. 5天、出生第2天、出生第50天）,比较野生型与PrxⅡ基因敲除型小鼠皮肤厚度、毛囊数量,并采用蛋白免疫印迹方法检测皮肤组织中β-连环蛋白（β-catenin）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、C-Myc癌基因表达水平。结果表明：与野生型小鼠相比,胚胎期第16. 5天、出生第2天PrxⅡ基因敲除型小鼠皮肤厚度无明显变化;胚胎期第16. 5天PrxⅡ基因敲除型小鼠毛囊数量无明显变化,出生第2,50天PrxⅡ基因敲除型小鼠毛囊数量明显增加;胚胎期第16. 5天PrxⅡ基因敲除型小鼠β-catenin、Cyclin D1和C-Myc癌基因表达水平无明显变化,出生第2天PrxⅡ基因敲除型小鼠皮肤组织中β-catenin、Cyclin D1和C-Myc癌基因表达水平明显上升。说明在PrxⅡ基因敲除小鼠皮肤组织中,β-catenin、Cyclin D1、C-Myc癌基因表达水平上升,参与毛囊发育过程,调节毛囊数量。

HDAC6对HepG2细胞增殖与转移潜能影响机制研究

目的肝癌相关基因突变的不断积累会导致肿瘤的发生,肝癌相关基因突变也涉及到细胞增殖、凋亡等的改变。组蛋白脱乙酰基酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)参与肿瘤的发生与发展,本研究探讨HDAC6过表达质粒转染肝癌细胞株HepG2对肝癌细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响。方法将人肝癌细胞株HepG2(购自中国科学院上海生命科学研究院)分为空白组、阴性对照组和过表达组(P3-HDAC6组),空白组予以常规培养,阴性对照组和P3-HDAC6组则分别转染空质粒和过表达质粒P3。运用蛋白质印迹法检测HDAC6、过氧化物酶(PrxⅡ)蛋白及上皮-间质转化(epithdlid-meserchymal transition,EMT)相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)在肝癌细胞株中的表达量变化,运用细胞增殖实验(cell counting kit8,CCK8)和Transwell实验检测HepG2细胞的增殖、迁移及侵袭能力;流式细胞仪检测各组HepG2凋亡的变化情况。结果蛋白质印迹法检测结果提示,HDAC6在HepG2细胞株中表达量下调,HDAC6表达量在P3-HDAC6组与阴性对照组分别为2.761±0.304和1.037±0.249,F=46.410,P<0.001;其下游作用蛋白PrxⅡ表达分别为1.026±0.183和1.842±0.229,F=18.532,P=0.003;E-cadherin在HepG2细胞株中表达上调,其表达量在P3-HDAC6组与阴性对照组分别为1.858±0.293和0.924±0.211,F=16.745,P=0.004;N-cadherin、Vimentin在HepG2细胞株中表达下调,其表达量在P3-HDAC6组为0.854±0.193和1.565±0.286,在阴性对照组分别为1.315±0.204和2.011±0.356,两组比较差异均有统计学意义(F=8.120,P=0.020;F=8.114,P=0.020)。CCK-8实验表明P3-HDAC6组2.137±0.228的HepG2细胞增殖能力较空白组(2.508±0.169)和阴性对照组(2.451±0.225)降低,差异有统计学意义,F=9.479,P=0.014;Transwell实验则提示,HDAC6能够减弱肝癌细胞的迁移、侵袭能力,P3-HDAC6组(80.67±6.028)的HepG2细胞迁移能力较空白组(234.3±5.963)及阴性对照组(198.0±7.732)降低,差异有统计学意义,F=44.188,P<0.001;P3-HDAC6组(79.33±7.202)的HepG2细胞侵袭能力较空白组(158.3±5.764)及阴性对照组(137.7±4.453)降低,差异有统计学意义,F=46.807,P<0.001。细胞凋亡实验显示,P3-HDAC6组〔(40.77±1.123)%〕与空白组〔(17.67±0.602)%〕及阴性对照组〔(19.13±0.378)%〕细胞凋亡率增加;差异有统计学意义,F=834.361,P<0.001。结论 HDAC6过表达通过调节PrxⅡ,降低使其氧化还原酶活性,从而抑制肝癌细胞株HepG2的增殖能力,降低迁移和侵袭水平,促进凋亡。