小鼠骨髓巨噬细胞过继性回输的体内示踪及其在高血压心脏损伤中的应用研究

目的通过增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转基因和CD45.1两种工具小鼠,进行小鼠骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMM)过继性回输后体内示踪的研究。利用小鼠高血压模型,观察回输BMM对高血压心脏损伤的作用。方法以EGFP转基因小鼠为供体,分离骨髓细胞,以巨噬细胞集落刺激因子诱导制备骨髓巨噬细胞。尾静脉回输EGFP+BMM到野生型小鼠。受体小鼠分2组:①实验组:每只注射2×106EGFP+BMM;②对照组:注射等体积磷酸盐缓冲液(PBS)。术后1、7 d观察受体小鼠外周血中EGFP+细胞存活和比例;7 d后收取小鼠心、肾、脾和肝脏组织,观察GFP+细胞的表达。以CD45.1小鼠为供体,CD45.2小鼠为受体,同上进行BMM回输,术后7 d检测受体小鼠外周血中CD45.1+细胞的比例。利用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)灌注建立小鼠高血压模型,同时回输PBS或EGFP+BMM。灌注后7 d,观察EGFP+BMM在心脏的浸润、心脏炎性反应和纤维化。结果 EGFP+BMM回输后1、7 d,外周血中EGFP+细胞比例分别为[1st day:(4.6±0.5)%;7th day:(4.4±0.5)%],对照组外周血中无EGFP+细胞存在。回输第7天,受体小鼠脾脏中有GFP+细胞表达,心、肾、肝中无GFP+细胞表达。CD45.1+BMM回输后第7天,外周血中CD45.1+细胞比例为(4.3%±0.4)%,对照组中无CD45.1+细胞。与对照组相比,AngⅡ灌注促进血压升高、心脏中炎性细胞浸润和胶原沉积。AngⅡ灌注后,回输的EGFP+BMM能浸润到心脏,促进心脏中炎性反应和纤维化,但不影响血压升高。结论该方法解决了BMM的过继性回输后体内的标记示踪问题,回输BMM可以在受体体内存活,而且证实巨噬细胞回输促进高血压心脏纤维化的发生。

供者淋巴细胞输注治疗无效的移植后复发患者过继性回输NK细胞的免疫学变化和临床疗效

目的:探讨异基因造血干细胞移植后(allo-HSCT)复发患者在供者淋巴细胞回输(DLI)治疗无效后过继性回输NK细胞后的免疫学变化及临床疗效。方法:选取2011年2月至2014年1月于北京大学血液病研究所进行allo-HSCT且移植后复发患者8例,其中同胞HLA全合4例、单倍型相合4例,移植复发后过继性回输供者来源的体外扩增NK细胞,并在回输后每周留取1次外周血,共5周,检测回输后患者体内NK细胞数量和功能的变化规律,并初步评估NK细胞回输后安全性及临床疗效。结果:8例患者中有4例NK细胞回输治疗后有反应:3例由微小残留病阳性转为阴性,1例髓外复发转阴。免疫学监测显示,治疗有反应病例回输后NK细胞活化型受体NKG2D、NKp30及NKp46表达及CD107a分泌水平较无反应组明显升高。随访至allo-HSCT后5年,3例无白血病长期存活,其余死亡。NK细胞回输安全,未见明显不良反应,5例患者NK细胞回输前存在慢性移植物抗宿主病,NK细胞回输后移植物抗宿主病未加重甚至缓解。结论:初步结果显示,移植后复发或持续微小残留病阳性患者,过继性回输NK细胞治疗后有反应的患者伴有NK细胞活化型受体及功能恢复,无明显不良反应,但疗效和安全性尚需在大样本中进一步证实。

过继性回输Treg对小鼠同种胰岛移植物免疫排斥反应的影响

目的探讨过继性回输调节性T细胞(Treg)对同种胰岛移植术后胰岛功能恢复及移植物存活时间的影响。方法以C57BL/6小鼠为受体建立糖尿病模型,以Balb/c小鼠为供体进行肾包膜下同种小鼠胰岛移植。根据处理方法不同将受体小鼠分为3组:Treg实验组(Treg组,术前1d经尾静脉注射1×10^6个Treg细胞)、阳性对照组[西罗莫司(SRL)组,术前1d开始给予300μg/(kg·d)SRL灌胃]和空白对照组(对照组,术前1d开始每日给予等体积生理盐水灌胃),每组3只。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠术后14d内血糖、C肽变化情况;通过活体成像技术动态监测小鼠移植物术后14d内存活情况。结果与移植术前比较,术后3d各组小鼠血糖水平均显著降低(均为P<0.001)。术后1d各组小鼠C肽水平均出现不同程度的爆发性回升,术后3d各组小鼠C肽水平较术前明显升高(均为P<0.001)。在术后14d观察期结束时,与对照组比较,SRL组与Treg组C肽水平仍相对较高[(427±50)、(833±57)pmol/L];而两组的血糖水平[(14.5±0.5)、12.1±0.6)mmol/L]均显著低于对照组(均为P<0.001)。与SRL组比较,Treg组C肽爆发性释放量更低,下降趋势明显更加平缓,观察期结束时C肽水平较高(均为P<0.001)。术后14d对照组的移植物几乎完全凋亡,SRL组有>50%的移植物存活,Treg组有>80%的移植物存活。结论过继性回输Treg能有效保护胰岛移植物,延长移植物存活时间,维持移植小鼠血糖以及C肽的正常水平。

自然杀伤细胞对小鼠HepS肝癌移植瘤的抑制作用研究

目的 研究自然杀伤（NK）细胞对原发性肝癌Heps移植瘤小鼠的治疗作用和机理.方法 建立小鼠移植性肝癌（Heps）实体瘤模型,随机分为生理盐水（NS）组、治疗1组（输注的NK细胞数为1×104/只）、治疗2组（输注的NK细胞数为1×105/只）和治疗3组（输注的NK细胞数为1×106/只）,每组15只.接种肝癌细胞当天,分别于尾静脉注射不同数量的NK细胞,对照组注射NS.观测小鼠移植瘤体积及各组小鼠平均生存时间.各组于输注NK细胞后第15天分别处死2只小鼠,对移植瘤组织切片进行HE染色,用流式细胞术（FCM）检测脾细胞NK的含量;乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测脾细胞杀伤活性.结果 接种移植瘤后第8天,治疗3组移植瘤的生长速度较其他组小鼠显著减慢（P＜0.05）.第20天时治疗1组移植瘤体积明显小于对照组（P＜0.05）,治疗2组和3组移植瘤体积非常显著小于对照组（P＜0.01）.治疗1组小鼠平均生存期明显长于对照组和治疗2、3组（P＜0.01）.治疗1-3组脾细胞杀伤活性以及NK细胞的含量高于对照组（P＜0.01）.结论 适量输注NK细胞可以有效抑制HepS肝癌移植瘤的生长,延长小鼠的生存期,为临床应用NK细胞治疗时数量的选择提供了实验依据.