过表达甘油激酶三角褐指藻藻株富集油脂的研究

为了得到高产并符合生物柴油标准的微藻油脂的藻株,本文研究了在外源甘油存在的情况下野生型(WT)三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum),甘油激酶过表达藻株(GKOE)以及甘油激酶RNA干扰藻株(GKRNi)在添加浓度为20 mmol/L外源甘油的培养基中的生长情况、油脂产量以及脂肪酸组成.结果显示:(1)甘油兼养的GKOE藻细胞浓度可达到2.23×107个/mL,明显高于甘油兼养的WT的1.79×107个/mL和GKRNi的1.78×107个/mL;(2)甘油兼养的GKOE油脂含量可达到31.73%,比甘油兼养的WT和GKRNi分别高了27.20%和26.63%;(3)尼罗红染色显示甘油兼养的GKOE荧光强度比甘油兼养的WT和GKRNi分别高16.26%和17.83%;(4)甘油兼养的GKOE总脂肪酸产量可达到0.052 mg/mL,比甘油兼养的WT和GKRNi高了36.84%和10.64%,说明其油脂适合于生物柴油开发.

甘油激酶基因对三角褐指藻理化性质的影响

为了探索甘油激酶(glycerol kinase,GK)基因对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)生长的影响,以GK基因过表达藻株、干扰藻株和野生型藻株为研究对象,测定了其生长情况、GK基因转录水平、GK活性、脂质含量和金藻昆布多糖等参数.结果显示:转基因藻株的比生长速率与野生型藻株无显著差异;过表达藻株GKOE1-8、GKOE7-1的转录水平显著上调,GK活性增强了3.55倍和2.58倍,中性油脂含量增加64.95%和18.49%,金藻昆布多糖含量增加50.89%和42.11%;而干扰藻株GKRNAi3-1、GKRNAi4-1的转录水平则显著下调,伴随着GK活性降低52.34%和6.64%,中性油脂含量减少26.88%和16.98%,金藻昆布多糖含量减少16.99%和10.62%.研究结果表明:在三角褐指藻中,过表达甘油激酶基因可以促进中性油脂和金藻昆布多糖等生物活性物质的积累,这为通过基因工程的手段获得产油率高的转基因藻株提供了参考.

三角褐指藻GPAT生物信息学及表达差异分析

三羧酸甘油酯(TAG)是植物细胞中油脂的主要储存形式,甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)是TAG生物合成过程中的第1个限速酶。为探明三角褐指藻油脂含量变化与GPAT基因表达量之间的关系,本研究利用转录组测序结果设计引物,采用RT-PCR技术克隆了三角褐指藻GPAT的c DNA全长,并对其进行生物信息学分析;通过RT-q PCR研究不同光照强度和温度下三角褐指藻GPAT的表达差异及总脂含量。结果表明,三角褐指藻GPAT的c DNA全长序列为1 743 bp,含有1个长度为1 305 bp的ORF,编码434个氨基酸,含有3个保守序列区。保守结构域分析表明,三角褐指藻GPAT属于LPLATs超家族,且具有GPAT特征性的酰基结合位点。系统进化分析表明,三角褐指藻GPAT与大洋洲海链藻的亲缘关系最近。RT-q PCR结果显示,随着光照强度和温度的提高,三角褐指藻GPAT表达量均呈先上升后下降的趋势,且在25℃、37.5μmol·m-2·s-1时达到最大值,与藻体内总脂含量变化趋势一致;此外,GPAT表达量与总脂含量随着温度的变化呈显著正相关(r=0.980,P<0.05),推测三角褐指藻GPAT可能是三角褐指藻脂类代谢途径的关键基因。本研究为今后利用基因工程手段提高植物体内油脂含量提供了优质的基因资源,同时为进一步揭示三角褐指藻脂类物质合成的分子调控机制奠定了一定的理论基础。

同源重组敲除三角褐指藻基因的研究

为探索应用基因敲除技术研究三角褐指藻基因功能的研究体系,本文以三角褐指藻甘油激酶基因作为靶基因,构建了同源重组基因敲除载体,利用微弹轰击法将该载体成功转化至三角褐指藻中,经100μg/mL Zeocin筛选和PCR验证获得了34个阳性转基因藻株;并进一步对三角褐指藻甘油激酶基因敲除转基因藻株的甘油激酶表达量和生长两方面进行分析,结果显示胞外甘油兼养不影响转基因藻细胞生长,甘油激酶不表达或表达量降低.本文通过构建敲除载体,完成了遗传转化,筛选获得阳性转基因藻,并进一步研究了转基因藻的性状,最终建立了应用同源重组基因敲除技术靶向研究三角褐指藻基因功能的研究体系.

三角褐指藻甘油兼养条件下甘油激酶的功能研究

本研究利用RT-PCR结合RACE方法扩增出了三角褐指藻甘油激酶(PtrGK)基因全长cDNA序列,其完整ORF为2079bp,编码692个氨基酸.基于上述序列构建了甘油激酶原核表达载体.构建反向互补RNA干扰载体并转化野生型三角褐指藻,得到含有甘油激酶反向互补干扰结构的转基因藻.研究表明:其甘油激酶表达水平、利用某油速率和细胞分裂速度都较野生型藻有了较大程度的下降.说明甘油激酶对三角褐指藻甘油兼养生长的重要作用.