野生番茄LA2157中热稳定抗根结线虫基因Mi-9候选基因的分离与过表达载体构建

根结线虫是番茄上的重要土传病害,选育抗根结线虫品种是最有效的防治方法,但是目前转育到栽培番茄中的抗根结线虫基因Mi-1在土温高于28℃时就丧失了抗性。本试验利用热稳定抗根结线虫野生番茄材料LA2157,根据Mi-1基因的序列信息,对其中热稳定抗根结线虫Mi-9基因进行同源克隆,在LA2157中共获得2个候选基因片段;通过In-Fusion克隆技术,将候选基因与过表达载体p BI121进行连接,经电泳检测和测序分析,最终构建Mi-9候选基因的过表达重组载体。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建

BRs(Brassinosteroids)是植物体内一种重要的类固醇激素,具有十分重要的生理功能。DWF 4是BRs生物合成的关键限速酶,显著影响BRs在植物体中的含量。本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克隆到全长为1542 bp的特异性条带,测序结果表明该条带为AtDWF4基因;生物学信息分析显示该基因可编码513个氨基酸(amino acid,aa),Proscale在线预测该蛋白为亲水性蛋白,且SOPM分析表明DWF 4蛋白含有α-螺旋(alpha-helix)、β-折叠(beta-fold)、β-转角(beta-angle)等多个二级结构。同时,研究还构建了含AtDWF4基因的超量表达载体pRI 201-RdDwf 4,并遗传转化烟草K 326,已获得抗性愈伤组织及抗性芽。本研究为进一步探究过表达AtDWF4基因对烟草形态及抗逆胁迫能力的影响提供理想的实验材料。

水稻OsPP6C基因的克隆、过表达载体构建与生物信息学分析

为克隆水稻蛋白磷酸酶6(PP6)催化亚基基因OsPP6C,并构建该基因的过表达载体以及进行生物信息学分析。采用RT-PCR技术从水稻中花11叶片cDNA中扩增OsPP6C基因全长,并构建与GUS融合的pBI121-OsPP6CGUS表达载体。通过生物信息学方法分析了OsPP6C蛋白的理化性质、与拟南芥AtPP6C(即AtFyPP)之间的同源性以及不同物种间的系统发育关系,此外,对OsPP6C基因的启动子进行了顺式作用元件分析。结果表明,该基因转录序列包含一个912 bp的开放阅读框,编码303个氨基酸残基,蛋白的分子量约为3.47 kDa,等电点为5.13;具有疏水性,但不存在信号肽,属于非分泌型蛋白。OsPP6C与拟南芥AtFyPP1和AtFyPP3氨基酸序列一致性分别为93.73%和93.40%,系统进化树显示OsPP6C与小麦TaPP6C的亲缘关系最近,而与其他物种亲缘关系相对较远。对该基因启动子中含有的顺式作用元件分析表明,该启动子中除TATA盒和CAAT盒外,还含有多种参与光应答、激素(ABA、乙烯、生长素、MeJA和赤霉素等)应答以及低温、热激和干旱等非生物胁迫因子应答的调控元件。为进一步研究水稻OsPP6C基因的表达特性和功能奠定了基础。

硒诱导的黄瓜耐镉转录本鉴定分析及表达载体构建

以黄瓜乙烯响应因子CsERF7转录本为研究对象,通过外源硒缓解黄瓜镉胁迫试验分析其表达及黄瓜生长状况,并克隆CsERF7基因,构建过表达载体转化拟南芥,同时分析CsERF7的理化性质和功能。结果表明,外源硒显著升高了镉胁迫引起的黄瓜生长指标的降低,CsERF7在镉处理下的表达丰度是对照的56%,而镉+硒比单独镉处理上调表达4.53倍,与RNA-seq结果相符,此基因可能在硒调控黄瓜镉胁迫响应中起作用。同时,成功构建超表达载体pEGOEP35S-H-ERF7-GFP,转化拟南芥获得转基因株系。生物信息学分析表明,黄瓜CsERF7基因属于AP2/ERF家族的AP2亚家族,开放阅读框ORF长度588bp,编码196个氨基酸,有1个AP2结构域;该蛋白属于非跨膜亲水性蛋白,亚细胞定位预测定位在线粒体中,存在22个氨基酸磷酸化位点;其二级结构主要由α-螺旋和延伸链构成,与三级结构预测结果高度一致,所得蛋白序列与黄瓜、甜瓜同源性最高。

AtCS25基因过表达载体的构建和拟南芥的遗传转化

AtCS25基因是拟南芥中一个功能未知的基因。生物信息学分析发现,该基因可能与花粉和花粉管的发育有关。为了进一步探究该基因的功能,克隆了AtCS25基因的全长CDS序列,并将克隆得到的片段插入到过表达载体pBI121相应的位置,构建了AtCS25基因的过表达载体pBI121-AtCS25。通过农杆菌GV3101介导将该载体转入拟南芥Col生态型中,获得了5株转基因植株,为进一步研究AtCS25基因的功能奠定了良好的基础。

湖羊Sp1基因CDS区克隆及其对颗粒细胞增殖和凋亡的影响

旨在探讨湖羊Sp1基因序列特征及其对颗粒细胞增殖及凋亡的影响。采用克隆、测序获得湖羊Sp1基因CDS区并用生物信息学方法分析其序列特征;NJ方法构建基于Sp1氨基酸序列的系统进化树;RT-PCR方法检测Sp1基因湖羊组织表达谱;克隆方法构建湖羊Sp1过表达载体;试剂盒检测Caspase-3活性和CCK-8值;利用流式细胞术检测人卵巢颗粒细胞(KGN)凋亡率。结果表明,湖羊Sp1CDS区长2 340bp,编码779个氨基酸残基,与人的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为94.28%和95.75%;湖羊与牛的亲缘关系最近;Sp1基因在湖羊卵巢、卵泡等组织中广泛表达。本研究成功构建了湖羊Sp1过表达载体并转染人卵巢颗粒细胞(KGN);试验组Caspase-3活性显著高于对照组(P<0.05),CCK-8值检测结果相反。表明过表达Sp1基因抑制KGN-细胞增殖(P<0.05)、促进KGN-细胞凋亡(P<0.05)。Sp1基因在哺乳动物中高度保守,湖羊Sp1基因可抑制人卵巢颗粒细胞(KGN)增殖、诱导其凋亡。

纳豆芽孢杆菌men基因过表达菌株的构建及提高溶氧强化MK-7合成

近年来,维生素K2更多的生理功能被发现,除了促进凝血之外,还能预防骨质疏松症和心血管疾病,有望治疗肿瘤和帕金森症.纳豆芽孢杆菌是被美国食品药品管理局认证的一种益生菌,可以用来生物制备维生素K2,其主要的产物形式为人体内半衰期较长、生物利用度较高的MK-7,在规模化生物制备维生素K2中的应用潜力较大.本研究优化枯草芽孢杆菌的Sipizizen转化法,使其适用于纳豆芽孢杆菌的分子转化;构建甲萘醌合成途径所涉及的全部8个men基因的过表达载体,并考察其转化纳豆芽孢杆菌之后发酵MK-7的性能变化;筛选出对MK-7合成影响较大的3个酶,分别为异戊烯基转移酶(MenA)、1,4-二羟基-2-萘甲酰辅酶A合酶(MenB)和去甲基萘醌甲基转移酶(MenG).通过对menA、menB和menG组合过表达筛选出一株MK-7产率较高的改造菌株(BN-pABG).在5L发酵罐中,通过供氧调控进一步优化其合成MK-7的生理过程,改造菌株的终产量为62.21 mg/L,较出发菌提高了1.26倍.这些结果表明menA、menB和menG组合过表达后对纳豆芽孢杆菌合成MK-7具有较强的促进作用,同时供氧条件的优化也对MK-7的合成有提升效果.(图6表6参21)