荧光PCR-毛细管电泳法在人运动神经元存活基因1和运动神经元存活基因2检测中的应用

目的建立荧光PCR-毛细管电泳(PCR/CE)方法,检测人运动神经元存活基因1(SMN1)和运动神经元存活基因2(SMN2),评价其性能。方法采用PCR/CE方法和SMA基因诊断的金标准多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA),同步盲法对样本进行检测。以MLPA检测结果为标准,检测PCR/CE方法的性能。结果本次共纳入样本336例,其中纯合缺失型50例(14.9%),杂合缺失型65例(19.3%),无缺失型221例(65.8%)。PCR/CE方法检出SMN1和SMN2拷贝数为0、1、2、3、≥4的结果与MLPA方法检测结果完全一致。结论PCR/CE方法用于SMA相关的基因检测,可准确检出SMN1和SMN2基因第7号外显子和第8号外显子拷贝数(0、1、2、3、≥4)。

等位基因特异性扩增法检测脊髓性肌萎缩运动神经元生存基因缺失

目的用单链构象多态性(SSCP)、限制性片段长度多态(RFLP)的方法诊断脊髓性肌萎缩(SMA)较普遍,但方法复杂。该文采用等位基因特异性扩增法进行SMA基因诊断,以探讨该方法的实用性和特异性。方法应用等位基因特异性扩增法对40名SMA患者(Ⅰ型15例,Ⅱ型17例,Ⅲ型8例)和40名正常对照进行运动神经元生存基因(SMN)基因外显子7的基因缺失研究。所有SMA患者均经RFLP方法证实缺失SMN1基因外显子7。结果等位基因特异性扩增法检测所有SMA患者均存在SMN1基因外显子7缺失,与RFLP的结果一致(诊断符合率为100%)。结论等位基因特异性扩增是既简便又实用的SMA基因诊断方法。

外源性FGF-2对损伤面运动神经元降钙基因相关肽表达的调节

目的:研究外源性成纤维细胞生长因子－２(ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＦＧＦ－２)对损伤面运动神经元降钙基因相关肽(ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｇｅｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅ,ＣＧＲＰ)代谢的调节作用。方法:采用大鼠面神经损伤模型,在损伤面神经近侧断端加人外源性ＦＧＦ－２,同时以生理盐水做对照,观察面运动神经元ＣＧＲＰ兔疫阳性细胞数和灰度值。结果:与生理盐水组比较,ＦＧＦ－２Ⅰ组和ＦＧＦ－２Ⅱ组损伤侧面运动神经元ＣＧＲＰ染色强度明显下降(灰度值百分比:Ｐ＜０．０１);ＦＧＦ－２Ⅱ组损伤侧面运动神经元ＣＧＲＰ阳性细胞数减少(阳性细胞数比:Ｐ＜０．０５)。结论:外源性ＦＧＦ－２对损伤面运动神经元ＣＧＲＰ的表达有负向调节作用。

远端型遗传性运动神经元病家系全基因组外显子测序研究

【目的】报告1例远端型遗传性运动神经元病(d HMN)家系,对家系进行分子遗传学研究,探寻致病基因,并探讨全基因组外显子测序在临床诊断和研究中的应用价值。【方法】对该家系进行临床及电生理检查,在排除与临床诊断相关已知基因的突变后,先对该家系的先证者和另一旁支的患者进行全基因组外显子测序、生物信息学分析,然后对采集到血样的22名家系成员,包括10例患者进行突变筛查及突变与疾病共分离分析。【结果】全基因组外显子测序、突变筛查及突变与疾病共分离分析结果显示该家系先证者和患者BSCL2基因3号外显子糖基化位点发生p.Ser90Leu突变,为国内首次报导。【结论】d HMN是一类临床和遗传异质性都很强的遗传病,外显子测序是诊断d HMN的有效方法。在研究具有高度遗传异质性的遗传病时,运用外显子组测序技术发现致病性突变比常规的PCR加产物测序更为简便、快速。

成纤维细胞生长因子-2对损伤面运动神经元代谢的影响

目的 研究外源性成纤维细胞生长因子 2 (FGF 2 )对损伤面运动神经元降钙基因相关肽 (CGRP)和FGF 2表达的影响。 方法 采用大鼠面神经损伤模型 ,在损伤面神经近侧断端加入FGF 2 ,同时以生理盐水做对照 ,观察面运动神经元CGRP和FGF 2免疫阳性细胞数和灰度值。 结果 单纯损伤组和生理盐水组 ,损伤侧面运动神经元CGRP阳性细胞数和染色强度比对照侧明显增强 ,而FGF 2则表达下降 ;与生理盐水组比较 ,FGF 2处理组损伤侧面运动神经元CGRP阳性细胞数和染色强度明显下降 ,FGF 2阳性细胞数和染色强度增加。 结论 外源性FGF 2能增强面运动神经元FGF 2的表达 ,但对损伤面运动神经元CGRP的表达有负向调节作用。

应用2种方法检测脊肌萎缩症运动神经元生存基因1缺失

目的:探讨脊肌萎缩症的基因诊断方法。方法:基于运动神经元生存基因的2个同源拷贝碱基上的差异,应用PCR-酶切和等位基因特异性PCR对8例脊肌萎缩症患者与其直系亲属及10例正常对照者对照进行脊肌萎缩症基因第7外显子缺失检测。结果:PCR-酶切和等位基因特异性PCR均显示8例脊肌萎缩症患者运动神经元生存基因第7号外显子缺失,正常对照组及患者亲属未发现缺失。结论:PCR-酶切结合等位基因特异性PCR是可靠的运动神经元生存基因缺失检测方法,提高了脊肌萎缩症基因诊断的准确性。

脊髓性肌萎缩症患儿中运动神经元生存基因转化的遗传分析

目的探讨脊髓性肌萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）患儿运动神经元生存基因1（survivalmotorneuron1，SMNj）向SMN2基因的转化及其与临床表型的关系。方法对417例SMNl第7外显子纯合缺失的患儿，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态方法筛查SMNl第8外显子是否纯合缺失，并通过基因组测序、多重连接探针扩增以及克隆测序等方法进行转化基因类型的研究和验证。结果在417例患儿中，31例（7．4％）未发现第8外显子纯合缺失，基因组测序等实验证实这些患者均携带SMNl／SMNZ融合基因。根据基因互换的位置，共存在5种不同的转化类型：SMN2-17b／SMNlE8、sMN2-17a／SMNl17b、SMN2-E7／SMNl17a、SMNl16／SMN2E1／sMNlITa以及SMN2-E7／SMNl17a／SMN217b。SMN基因转化在I型～Ⅲ型患儿中均存在，10例经转化后SMN2拷贝数为3的I型～Ⅲ型患儿的平均生存年龄为5岁4月。结论中国SMA人群中存在SMNl基因的部分转化，并在一定程度上影响了患儿（尤其是I型）的生存。

人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞及运动神经元生存蛋白表达的研究

目的 定向诱导人骨髓间质干细胞(hMSC)分化为神经元样细胞,并检测诱导前后细胞的运动神经元生存(SMN)基因mRNA及蛋白质的表达。方法 分离和纯化hMSC;在体外用碱性成纤维细胞生长子预诱导hMSC,再用二甲基亚砜和丁化羟基苯甲醚诱导hMSC分化为神经元样细胞;用免疫细胞化学方法鉴定诱导前后的细胞是否表达神经元特异性标志物神经元稀醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)以及SMN蛋白;用RT- PCR检测诱导前hMSC及诱导后神经元样细胞SMN基因mRNA的表达。结果 hMSC诱导3h后,大多数细胞转变为类似于神经元的形态,有长的突起,相互之间连接呈网状。NSE、NF进行鉴定,结果显示NSE、NF呈阳性。诱导前的hMSC及诱导后的神经元样细胞均可见SMN基因mRNA表达,但诱导后表达增加,差异有统计学意义(P<0 .01),且诱导后神经元样细胞SMN蛋白表达为阳性。结论 hMSC能分化为神经元样细胞,并表达神经元的特异性标志物。hMSC分化的神经元样细胞既能高表达SMN基因的mRNA,也表达SMN蛋白。

远端遗传性运动神经元病Ⅴ型一家系的基因分析

目的对1个远端遗传性运动神经元病Ⅴ型家系进行基因及产前诊断。方法应用PCR-测序技术检测该家系先证者GARS和BSCL2基因外显子的突变情况,检测其家系成员及100名健康对照突变位点的碱基序列以排除多态性。为家系中的孕妇提供产前诊断。结果PCR-测序结果显示先证者GARS基因未见突变,BSCL2基因存在c.269C>T(p.S90L)杂合突变,使丝氨酸密码子(TCG)突变为亮氨酸密码子(TTG)。家系中其他3例患者该位点同样存在BSCL2c.269C>T(p.S90L)杂合突变,家系中未患病者及100名健康对照该位点未见突变。产前诊断结果显示羊水标本该位点未见突变。结论该远端遗传性运动神经元病Ⅴ型家系存在BSCL2基因的致病性突变,产前诊断表明胎儿的BSCL2基因未发生突变。

荧光定量PCR快速筛查脊髓性肌肉萎缩症smn1致病基因携带者

目的采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测脊髓性肌肉萎缩症(SMA)运动神经元生存基因1(smn1)基因拷贝数,快速筛查SMA致病基因携带者。方法采用荧光定量PCR技术检测经多重连接探针扩增技术(MLPA)确认的21例SMA携带者、79例健康人群标本,及另200例本地人群标本。结果 21例SMA携带者及79例健康人群标本检测结果与MLPA符合率均达100.0%;200例本地人群标本中,4例smn1基因拷贝数为1(为携带者),占2.0%;173例smn1基因拷贝数为2,占86.5%;23例smn1基因拷贝数为3,占11.5%。结论荧光定量PCR技术是1种快速、简便和准确的SMA致病基因携带者检测技术。

儿童型脊肌萎缩症SMN基因缺失与微突变检测

目的研究儿童型脊肌萎缩症(SMA)患者中运动神经元生存基因缺失与微突变情况。方法收集经临床和肌肉活检确诊的SMA I^III型25例,其中I型5例,II型3例,III 17例及直系亲属24例。采用PCR-RFLP检测SMNt缺失情况,对无SMNt缺失的患者及SMA直系亲属,应用PCR-SSCP结合DNA序列分析的方法,进行SMN基因微突变分析。结果5例I型和3例II型SMA患者均见SMNt缺失,缺失率100%,6例III型见缺失,缺失率35%(6/17)。11例无缺失的SMA III型患者的gDNA编码区域未发现微突变;24例SMA的直系亲属中未发现SMN基因缺失及突变。结论①检测到SMNt外显子7缺失可作为SMA的确诊手段,有望替代肌电图和肌活检等有创检查;②对无SMNt外显子7缺失的III型SMA患者,要结合临床进行诊断;③该组无SMNt缺失的III型患者未发现微突变,提示存在遗传异质性。[中国当代儿科杂志,2005,7(6):489-492]

运用DHPLC技术进行脊髓性肌萎缩症SMN-T基因缺失检测的初步研究

目的评价变性高效液相色谱技术(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)在脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA)端粒运动神经元生存基因(survivalmotorneurontelomericcopy,SMN-T)缺失筛查中的应用价值。方法应用扩增限制性长度多态性技术(PCR-RFLP)、DHPLC及DNA测序技术对51例SMA患儿及其双亲与67例非SMA患儿SMN-T与着丝粒运动神经元生存基因(survivalmotorneuroncentromericcopy,SMN-C)碱基差异位点exon7(C/T)与exon8(G/A)进行检测。结果PCR-RFLP与DHPLC技术均同时检出45例SMA患儿SMN-T基因exon7+8或exon7纯合缺失,DNA测序证实了PCR-RFLP与DHPLC检测的可靠性。在DHPLC检测中发现,6例非SMN-T纯合缺失患儿的SMN-T与SMN-C基因拷贝数存在不平衡;在SMN-T基因纯合缺失患儿双亲中,75.5%(77/102例)的个体两基因拷贝数存在不平衡;在非SMA对照组中,22.4%的个体(15/67例)两基因拷贝数存在不平衡,两组个体基因拷贝不平衡频率差异有显著性。结论DHPLC技术不仅能快速有效地检出SMN-T基因的纯合缺失,而且通过比较SMN-T与SMN-C基因拷贝数平衡与否,可初步提示患儿SMN-T基因杂合缺失状态与双亲基因缺失的携带者状态,为进一步的基因突变筛查与产前诊断提供依据。

儿童脊肌萎缩症的基因诊断

目的对临床诊断疑似为脊肌萎缩症(SMA)的患儿进行运动神经元生存基因(SMN)缺失分析,通过基因诊断对SMA进行确诊。方法收集2015年1月至2016年12月上海市儿童医院新生儿科及神经内科就诊的疑似SMA患儿29例,患儿就诊年龄11 d～14岁。采用多重连接探针扩增(MLPA)技术对上述患儿外周血DNA样本进行基因诊断。结果 15例存在SMA致病突变,疑似患儿的SMA基因诊断率为51.7%(15/29)。其中8例为SMN1基因外显子7和外显子8纯合缺失;3例为SMN1基因外显子7和外显子8纯合缺失,SMN2基因外显子7拷贝数增加;4例为SMN1基因外显子7纯合缺失,外显子8杂合缺失。另外14例存在不直接致病的突变。按照SMA国际诊断标准,15例确诊患者中Ⅰ型5例,Ⅱ型5例,Ⅲ型5例,均占33.3%。其中Ⅰ型的5例患儿均为SMN1基因外显子7、8纯合缺失,仅有1例存在SMN2基因外显子7拷贝的轻度增加。结论 MLPA技术灵敏度较高,可作为SMA疑似患者首选的诊断方法,为SMA的明确诊断提供依据。

荧光短片段多重PCR在脊髓性肌萎缩症SMN1基因突变检测中的应用

目的设计特异性扩增引物,建立荧光短片段多重PCR技术检测SMN1基因拷贝数变异的方法,验证方法的检测性能并初步应用于基因拷贝数检测。方法选取107例来自神经系统疾病生物样本库的人外周血DNA样品(包括SMN1基因0拷贝30例、1拷贝47例、2拷贝30例),设计5’端带有FAM荧光基团的SMN1基因7号外显子引物以及三对内参基因引物,利用荧光短片段多重PCR技术,使用基因分析仪片段分析多重PCR的产物,并与相应的MLPA检测结果进行比较。结果特异性扩增SMN1基因7号外显子及内参基因的引物可实现目的片段的扩增,通过计算可得到0拷贝、1拷贝、2拷贝的样本结果。对107例DNA样本的SMN1基因拷贝数荧光短片段多重PCR的检测结果进行分析,实验结果均与MLPA检测结果相一致。结论使用荧光标记多重PCR反应检测SMN1拷贝数可重复性好,精确度高,与MLPA得到的结果高度一致,具有便捷、准确、成本低的优势,可满足临床高准确性的检测要求,可用于SMA新生儿携带者的大规模筛查。

儿童脊髓性肌萎缩症的基因学研究

目的 研究我国儿童型脊髓性肌萎缩症 (SMA)患者的运动神经元生存 (SMN)基因及神经细胞凋亡抑制蛋白 (NAIP)基因外显子的缺失情况 ,以探讨此二种基因与SMA表型之间的关系。方法 应用PCR和PCR -酶切法检测 15例Ⅰ～Ⅲ型SMA患者 (Ⅰ型 4例 ,Ⅱ型 3例 ,Ⅲ型 8例 )、2 0例表型正常的SMA直系亲属及30例正常对照的SMN基因的第 7,8号外显子和NAIP基因的第 5 ,6号外显子缺失情况。结果 7例Ⅰ型和Ⅱ型SMA患者中 6例纯合缺失SMN基因外显子 7和 8,1例纯合缺失外显子 7而保留外显子 8;8例Ⅲ型SMA患者仅1例有外显子 7和 8的缺失 ,余 7例均无SMN基因的缺失 ;15例Ⅰ～Ⅲ型SMA患者均未检测到NAIP基因外显子5和 /或 6的缺失。结论 Ⅰ型、Ⅱ型SMA可通过SMN基因第 7,8号外显子的检测进行确诊 ,方法简便可靠 ,Ⅲ型SMA患者SMN基因缺失率低 ,故通过检测SMN基因 7,8外显子进行基因诊断尚需谨慎 ,NAIP基因在SMA发病中的作用尚不清楚 ,有待进一步研究。

荧光探针熔解曲线分析法快速检测SMN1基因纯合性缺失

目的建立一种快速检测SMN1基因纯合缺失的荧光探针熔解曲线分析方法。方法收集正常成人的外周血标本94份,经MLPA检测过的已知SMN1和SMN2基因拷贝数的样本238例。采用荧光探针熔解曲线分析技术,分别对SMN1基因c.840C>T和c.835-45G>A进行基因分型,根据基因分型结果判断是否存在SMN1基因exon7纯合缺失。对SMN1基因和SMN2基因拷贝数比值为2∶2、2∶0和0∶2基因型样本进行10倍梯度稀释,评估检测体系的敏感性。选取SMN1基因和SMN2基因拷贝数比值为2∶2、2∶0和0∶2基因型样本各8例,不同时间检测3次,用于评估检测体系的重复性。结果该方法可以方便地检测SMN1基因exon7纯合缺失,灵敏度至少为0.05ng基因组DNA。应用此方法检测94例正常成人样本,未发现SMN1基因exon7纯合缺失;对238例已知基因型样本进行检测,结果显示准确率为100%。结论荧光探针熔解曲线分析方法可以快速准确检测SMN1基因exon7纯合缺失,操作简单实用,适合大规模人群筛查和产前分子诊断。

应用PCR-酶切法进行脊肌萎缩症基因诊断

目的 探讨脊肌萎缩症 (SMA)的基因诊断方法。方法 基于运动神经元生存基因 (SMN)的两个同源拷贝碱基上的差异 ,应用PCR -酶切分析法对 10例临床和病理诊断为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型SMA的患者及其直系亲属 16人、2 5例正常对照进行SMN基因检测。结果 10例SMA患者中 9例患者缺失SMN第 7、8号外显子 ,1例患者仅缺失第 7号外显子 ;正常对照组及患者亲属均未发现外显子缺失。结论 PCR -酶切检测SMN基因第 7号、8号外显子缺失是诊断儿童型脊肌萎缩症可靠的基因诊断方法。

脊髓性肌肉萎缩症的基因诊断

目的 检测湖北省大冶市 1例脊髓性肌肉萎缩症 (SMA)先证者的运动神经元生存基因 (SMN)第 7外显子的基因缺失。方法 采用PCR DraI酶切法检测先证者及其 6位亲属及 30名正常对照的SMN基因的 7号外显子的缺失情况。结果 发现该患者缺失了端粒SMN基因 (SMNt)的第 7外显子 ,而正常对照及家系成员均未发现外显子的缺失。结论 PCR

成人型脊髓性肌萎缩症的基因研究

目的 :研究我国成人型脊髓性肌萎缩症 (SMA)患者的运动神经元生存基因 (SMN)及神经细胞凋亡抑制蛋白 (NAIP)基因外显子的缺失情况 ,以探讨此二种基因与成人型SMA之间的关系。方法 :应用PCR法检测 30例成人型SMA患者、30例表型正常的SMA直系亲属及 30例正常对照的SMN基因第7、8号外显子和NAIP基因第 5、6号外显子缺失情况。结果 :成人型 (IV型 )SMA未检测到SMN基因第 7、8号外显子及NAIP基因外显子 5和 (或 ) 6的缺失。结论 :成人型SMA未检测到SMN基因缺失 ,其发病可能与SMN基因缺失无关 ;NAIP基因在SMA发病中的作用尚不清楚 ,有待进一步研究。

脊髓性肌萎缩症的基因诊断

目的 探讨脊髓性肌萎缩症基因诊断方法。方法 应用PCR -酶切分析法对 2例SMA患儿进行运动神经元生存基因 (SMN)的基因诊断分析。结果 2例患儿SMN基因第 7,8外显子PCR产物经DraI、DdeI酶切后 ,仅剩下 16 5bp与12 5bp片断 ,显示为SMN基因 7号、8号外显子缺失。结论 PCR -酶切检测SMN基因 7号、8号外显子缺失可作为脊肌萎缩症的可靠基因诊断方法。