脊肌萎缩症家系运动神经元生存基因微小突变的鉴定

目的建立一套运动神经元生存（SMN）基因微小突变检测体系，以评价其用于脊肌萎缩症（SMA）家系的价值。方法采用RNA水平和基因组DNA水平双途径检测策略，用PCR一限制性片段长度多态性（RFLP）、位点特异性PCR、多重连接依赖性探针扩增（MLPA）和T克隆测序技术对2个SMA家系共7个成员行SMN基因微小突变分析。结果用MLPA和T克隆测序技术检测家系A的SMA患者有1个拷贝的SMN1基因，其第228位密码子上存在1个无义突变L228X，该突变来源于患者父亲；家系B的SMA患者父亲有2个SMN1基因，其中1个SMN1基因存在移码突变22_23insA。其余家系成员均为有1个SMN1基因拷贝的SMA携带者。结论建立的SMN微小突变检测体系成功鉴定了2个SMN微小突变，为SMA家系的遗传咨询提供了可靠依据。

荧光定量PCR快速筛查脊髓性肌肉萎缩症smn1致病基因携带者

目的采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测脊髓性肌肉萎缩症(SMA)运动神经元生存基因1(smn1)基因拷贝数,快速筛查SMA致病基因携带者。方法采用荧光定量PCR技术检测经多重连接探针扩增技术(MLPA)确认的21例SMA携带者、79例健康人群标本,及另200例本地人群标本。结果 21例SMA携带者及79例健康人群标本检测结果与MLPA符合率均达100.0%;200例本地人群标本中,4例smn1基因拷贝数为1(为携带者),占2.0%;173例smn1基因拷贝数为2,占86.5%;23例smn1基因拷贝数为3,占11.5%。结论荧光定量PCR技术是1种快速、简便和准确的SMA致病基因携带者检测技术。

破伤风毒素C端片段与心肌营养素-1融合蛋白表达、纯化与靶向神经元逆向运输及神经营养活性鉴定

目的在BL21（DE3）大肠杆菌中表达破伤风毒素C端片段（TFC）与心肌营养素（CT）-1融合蛋白并纯化。探讨TTC转导结构域对CT-1的靶向神经元逆向运输活性与CT．1的神经营养活性。方法异丙基-B—D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导BL2（DE3）大肠杆菌表达CT-1／TYC融合蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）与WB法鉴定融合蛋白表达。制备SD大鼠坐骨神经损伤模型，分别经神经再生室、肌肉注射给药，自由放养1周后处死，4％多聚甲醛灌注固定，取脊髓L4～L6腰膨大标本，冰冻切片，免疫组织化学检测。制备新生6～7d龄sD大鼠坐骨神经损伤模型，肌肉注射CT-1／TTC融合蛋白，自由放养1周后处死，4％多聚甲醛灌注固定，取L4～L6腰膨大标本，冰冻切片，尼氏染色计数脊髓前角运动神经元。结果原核表达目的蛋白CT-1／TTC表达量占全菌蛋白总量的15％，以可溶性蛋白为主。通过谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签亲和纯化获得2.7g／L的CT-1／TTC重组融合蛋白。免疫组织化学于脊髓腰膨大检测到CT-1／TTC融合蛋白。坐骨神经损伤后，脊髓L4-L6腰膨大前角运动神经元计数较CT-1／TTC融合蛋白处理组减少，存活率下降。结论基因重组CT-1／TTC蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，所获得的融合蛋白有靶向性脊髓神经元细胞的活性和对损伤后运动神经元的神经营养活性。

荧光短片段多重PCR在脊髓性肌萎缩症SMN1基因突变检测中的应用

目的设计特异性扩增引物,建立荧光短片段多重PCR技术检测SMN1基因拷贝数变异的方法,验证方法的检测性能并初步应用于基因拷贝数检测。方法选取107例来自神经系统疾病生物样本库的人外周血DNA样品(包括SMN1基因0拷贝30例、1拷贝47例、2拷贝30例),设计5’端带有FAM荧光基团的SMN1基因7号外显子引物以及三对内参基因引物,利用荧光短片段多重PCR技术,使用基因分析仪片段分析多重PCR的产物,并与相应的MLPA检测结果进行比较。结果特异性扩增SMN1基因7号外显子及内参基因的引物可实现目的片段的扩增,通过计算可得到0拷贝、1拷贝、2拷贝的样本结果。对107例DNA样本的SMN1基因拷贝数荧光短片段多重PCR的检测结果进行分析,实验结果均与MLPA检测结果相一致。结论使用荧光标记多重PCR反应检测SMN1拷贝数可重复性好,精确度高,与MLPA得到的结果高度一致,具有便捷、准确、成本低的优势,可满足临床高准确性的检测要求,可用于SMA新生儿携带者的大规模筛查。

基于RNA测序的SMN1基因缺失型脊髓性肌肉萎缩症的可变剪接差异性分析

目的通过分析运动神经元生存基因1(SMN1)基因纯合性缺失型儿童进行性脊髓性肌肉萎缩症(SMA)患者和SMN1基因拷贝数正常对照外周血淋巴细胞表达谱,研究SMN1基因缺失对可变剪接的影响。方法利用转录组测序对患者组与正常对照组进行表达谱测序,用rMATS软件对RNA-seq数据进行可变剪接事件差异分析,筛选出患者组与正常对照组中差异的外显子跳跃和内含子保留事件,通过在线工具NovoMagic v3.0对这些差异可变剪接体进行基因功能和代谢通路富集分析,实现个性化分析和作图,同时用NCBI数据库对这些基因进行注释。结果(1)SMN1基因纯合性缺失可导致外周血淋巴细胞mRNA可变剪接及其表达量发生变化;(2)外显子跳跃差异基因主要影响核糖核蛋白组装、胞内转运、翻译、乙酰化修饰、线粒体能量代谢及泛素化调控的降解通路;(3)内含子保留差异基因除参与泛素化调控、内吞、翻译、线粒体能量代谢外,同时还调节细胞骨架和代谢酶活性相关乙酰化修饰。结论SMN1基因纯合性缺失能够改变部分基因的可变剪接,进而影响相关蛋白的合成、组装和降解,最终导致蛋白质稳态失衡,为SMA的发病机制提供新的线索。

脊髓性肌萎缩症治疗临床研究进展

脊髓性肌萎缩症为常染色体隐性遗传性神经肌肉病,以脑干和脊髓运动神经元变性引起的进行性肌无力和肌萎缩为特征,是临床常见的婴儿致死性遗传性神经肌肉病。运动神经元生存1(SMN1)基因突变致SMN蛋白缺乏为其发病机制,深入了解疾病发病机制的分子学基础,以促进包括反义寡核苷酸、腺相关病毒介导的SMN1基因替代疗法、上调SMN蛋白表达的口服小分子药物,以及肌肉激活药物、神经保护药物等新兴特异性治疗方法的研发,降低病死率、改善患者生活质量。

小鼠病毒性面神经炎模型中面神经元凋亡的研究

目的探讨1型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1，HSV-1）性面神经炎动物模型中面神经运动神经元（facial motor neurons，FMN）的凋亡情况以及凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。方法Balb／c小鼠84只，分别进行HSV-1接种和面神经切断处理。在操作后第1、3、7、10、15、20及30天分批处死动物，对面神经核进行HE染色、尼氏染色；采用原位末端转移酶标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL）技术检测FMN的凋亡；免疫组化染色检测凋亡相关基因bcl-2和bax在FMN中的表达。结果面神经切断后，同侧FMN出现凋亡，在第10、15天达高峰，Bcl-2表达降低，Bax表达升高，Bcl-2／Bax比值下降；接种病毒后，同侧FMN没有明显的细胞凋亡，Bcl-2表达增高，在第15天达高峰，Bcl-2／Bax比值上升。结论小鼠面神经接种HSV-1后FMN没有明显凋亡，可能与神经损伤程度轻以及HSV-1抑制宿主细胞凋亡有关，Bcl-2、Bax可能参与调控FMN的凋亡。

154例脊肌萎缩症疑诊患者的基因诊断及其临床价值

目的对疑诊为脊肌萎缩症（SMA）患者的运动神经元存活基因SMNl进行缺失分析，探讨基因诊断对SMA的临床应用价值。方法采用PCR和限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）技术，对2007年1月至2014年12月于云南省第一人民医院遗传诊断中心和昆明医科大学第四附属医院神经内科就诊的154例SMA疑诊患者和20名健康体检者进行SMN1基因外显子7和外显子8缺失检测，统计上述基因的缺失频率，采用SPSS13．0软件对各缺失类型在不同SMA型别间的差异进行显著性检验。结果154例疑诊患者中，101例检出SMN1基因外显子7纯合缺失，基因诊断率为65．6％（101／154）。101例SMNl基因纯合缺失病例中，外显子7和8均纯合缺失为98例，占97．0％（98／101）；3例仅外显子7纯合缺失，占3．0％（3／101）；未见外显子8的单独缺失。基因诊断阴性患者经过临床随访，其中4例可维持SMA的诊断，105例SMA确诊患者中I型68例，Ⅱ型27例，Ⅲ型10例，分别占64．8％（68／105）、25．7％（27／105）和9．5％（10／105），未发现Ⅳ型SMA。20名健康体检者未检出SMN1基因外显子7和8缺失。结论PCR—RFLP技术对于诊断SMA患者具有无创性、简单、灵敏度和特异性较高的特点，可作为疑诊SMA患者的首选诊断和排除诊断方法；强化SMA临床诊断标准并对基因诊断阴性的疑诊患者进行重新评估，将有助于提高临床诊断的准确率和检出率。

利用实时荧光定量PCR分析孕中期羊水细胞SMN1基因缺失

目的探讨采用羊水样本进行脊髓性肌萎缩症（SMA）产前诊断的方法。方法利用基于短串联重复序列（STR）遗传标记的分子检测技术对2015年1月至2016年1月4家医院1064份孕中期妇女羊水进行母血污染检测，对无母血污染的羊水样本采用实时荧光定量PCR进行SMN1基因缺失情况检测，多重连接探针扩增（MLPA）验证实时荧光定量PCR的SMN1基因检测结果。结果1064份孕中期妇女羊水经STR分型检测，2份存在母血污染，其余1062份无母血污染的羊水样本经实时荧光定量PCR检测结果显示，39例孕妇胎儿存在SMN1基因第7外显子（E7）杂合缺失（3．67％），34例孕妇胎儿存在SMN1基因第8外显子（E8）杂合缺失（3．2％），2例孕妇胎儿存在E7纯合缺失、E8纯合缺失（0．19％），其余病例E7、E8均未发现缺失。MLPA对41例SMN1杂合或纯合缺失样本以及55例未检出SMN1缺失样本验证结果均与实时荧光PCR检测结果一致。结论实时荧光定量PCR及MLPA均可用于对孕中期妇女胎儿的SMN1基因缺失情况的检测，实时荧光定量PCR样本需求量少，检测更快速。