四氯化碳诱导近交系C57BL/6小鼠建立肝纤维化模型

目的比较不同剂量四氯化碳诱导近交系C57BL/6小鼠肝纤维化模型的效果,以建立稳定的肝纤维化模型。方法选择5周龄的C57BL/6近交系小鼠,分别腹腔注射给予高、中、低剂量的四氯化碳诱导肝纤维化,实验结束后取血及肝脏组织,检测血浆丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的水平及肝脏病理变化。结果近交系C57BL/6小鼠药物诱导后,各剂量组动物均能存活到8周,高剂量组存活率仅为20%远低于中、低组;血清转氨酶含量升高程度、肝组织病理改变存在剂量时间效应关系。病理分析表明,各剂量组均可见肝细胞变性/坏死、中央静脉周围/汇管区混合细胞浸润及肝脏纤维化。结论10%四氯化碳给药8周后能诱导近交系C57BL/6小鼠形成较稳定的肝纤维小鼠模型,为后续肝纤维化机制研究及药物筛选工作奠定了基础。

Notch信号对激光诱导的小鼠CNV生成过程中巨噬细胞极化表型及功能的调控

背景 巨噬细胞在脉络膜新生血管（CNV）中的作用尚存在争议,与其在不同微环境中的功能异质性有关,Notch信号通路参与眼内新生血管生长的调控,但其对CNV中巨噬细胞功能的调控作用尚未证实. 目的 探讨巨噬细胞在CNV生成中极化表型的变化与Notch信号通路对巨噬细胞极化表型的调控.方法 在体实验选择58只成年雄性C57BL小鼠,以随机数字表法按照造模后取材时间的不同随机分为光凝后3d组和7d组.每组选23只小鼠用视网膜光凝法诱导小鼠CNV模型,分别于光凝后3d和7d制备脉络膜铺片,采用免疫荧光染色法观察CNV面积和巨噬细胞阳性染色面积,血管内皮生长因子（VEGF）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的分泌情况;光凝后3d和7d对眼杯冰冻切片行免疫荧光染色,观察CNV中巨噬细胞的极化表型及其分泌VEGF、TNF-α的情况,评估巨噬细胞上Notch信号胞内段（NICD）相应分子标志物的表达情况.每组设定6只小鼠的左眼为正常对照眼,其右眼以激光光凝法建立CNV模型,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测眼杯组织中VEGF、TNF-α和巨噬细胞极化相关因子的表达情况.体外分离和培养C57BL小鼠的骨髓单核前体细胞,用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导其分化为巨噬细胞,加入Notch信号通路抑制剂γ-分泌酶抑制剂（GSI）和极化诱导因子,24 h后收集细胞及培养液上清,通过qRT-PCR及ELISA法检测M1型、M2型巨噬细胞分子表面标志物的表达水平. 结果 与光凝后第3天比较,光凝后第7天CNV面积明显增大,但巨噬细胞浸润面积缩小,差异均有统计学意义（t=8.138、5.272,均P=0.000）.光凝后第3天,巨噬细胞在CNV周边和中央均有分布,第7天时局限于CNV中央部.光凝后第3天,色素上皮-脉络膜-巩膜复合体中精氨酸合酶1（Arg1）、甘露糖受体（MR）及白细胞介素-6（IL-6）mRNA的相对表达量明显高于第7天,而诱导型一氧化氮合酶（iNOS） mRNA的相对表达量无明显改变.免疫荧光结果显示,光凝后第3天F4/80＋ Arg1＋细胞（M2型巨噬细胞）数量明显多于F4/80＋ iNOS＋细胞（M1型巨噬细胞）,光凝后第7天F4/80＋ Arg1＋细胞数量明显减少,差异均有统计学意义（t=7.348,P=0.000;t5.562,P＜0.001）,但仍多于F4/80＋ iNOS＋细胞,二者间差异有统计学意义（t=4.568,P＜0.01）.在光凝后3d时巨噬细胞分泌的VEGF和TNF-α明显多于光凝后7d,差异均有统计学意义（t=5.143、4.519,均P＜0.01）.巨噬细胞中Notch信号下游分子在光凝后3d时未见表达,7d时表达量明显增加,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.体外实验表明,阻断Notch信号后,M1型巨噬细胞分子标志物表达量明显下降,而M2型巨噬细胞分子标志物的表达量明显增加,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.结论 巨噬细胞的极化表型在CNV模型的不同阶段发生变化,而巨噬细胞中Notch信号的激活状态调控巨噬细胞的极化表型改变和功能.

小鼠视皮层发育过程中常规蛋白激酶Cγ亚型的动态表达及单眼剥夺对其表达的影响

背景弱视的发生与中枢神经系统可塑性变化有关，我们先前的研究发现synapsin参与视皮层的突触可塑性过程，而神经元特异性蛋白——常规蛋白激酶C1亚型（cPKC-γ）可能是synapsin的上游激酶之一，其在视觉发育可塑性中是否发挥或如何发挥作用尚未明确。目的观察随着小鼠发育其视皮层中cPKC-γ表达水平的动态变化以及异常视觉经验对cPKC-γ表达水平的影响。方法选取清洁级C57BL／6小鼠36只，分别于出生后（P）7、14、21、28、35、42d各选6只小鼠，取其两侧视皮层用于研究正常小鼠随鼠龄增加视皮层中cPKC-γ表达水平的变化。另外选取清洁级C57BL／6小鼠24只以随机数字表法随机分为发育期组和成年期组，每组12只。发育期组取6只P14小鼠行右眼上下睑缝合术以制备单眼剥夺（MD）模型，其余6只小鼠不进行干预作为对照，至P28取小鼠左右两侧视皮层；成年期组取6只P60小鼠以同样方法制备MD模型，其余6只不作干预作为对照，至P74取小鼠两侧视皮层。采用Westernbolt法检测小鼠两侧视皮层内cPKC-γ蛋白的表达变化。结果正常P7小鼠可见左右侧视皮层中cPKC-γ蛋白的微弱表达，表达量的相对值分别为（39．74＋11．22）％和（40．78±10．37）％，随鼠龄增加cPKC-γ蛋白的表达量逐渐增加；P21小鼠左右侧视皮层中cPKC-γ蛋白的表达量达峰值，分别为（138．68±15．73）％和（138．47±23．48）％，此后随鼠龄增加cPKC-γ蛋白的表达量逐渐减少并稳定。不同鼠龄正常小鼠视皮层中cPKC-γ表达量的总体比较差异有统计学意义（F鼠龄=57．174，P=0．000），各组小鼠左侧与右侧视皮层中cPKC-γ蛋白表达量的总体比较差异无统计学意义（F左事=0．059，P=0．809）。发育期组MD小鼠与成年期组MD小鼠间左右侧视皮层中cPKC-γ表达量的总体比较差异无统计学意义（F鼠龄=1．798，P=0．159），各组MD小鼠与正常对照小鼠间左右侧视皮层中cPKC-γ蛋白的表达量总体比较差异无统计学意义（F分组=0．104，P=0．749）。结论正常小鼠视皮层中cPKC-γ表达量的变化趋势与视觉发育可塑性关键期相一致；MD对小鼠视皮层中cPKC-γ蛋白表达量无明显影响，但是否对cPKC-γ蛋白的活性产生影响仍需进一步研究。

C57BL6近交系小鼠前列腺癌原位移植瘤模型的建立

的 建立C5 7BL6近交系小鼠前列腺癌原位移植瘤模型并探讨其应用价值。方法用微量注射器在C5 7BL6近交系小鼠的前列腺左右背外侧叶包膜下接种小鼠前列腺癌RM 1细胞2× 10 6个建立原位移植瘤模型 ,以皮下移植瘤模型作为对照比较两者的肿瘤转移发生情况及生存期。结果 原位模型小鼠全部发生肿瘤转移 ,其中盆腔淋巴结和肺的转移发生率分别为 ( 10 / 10 )、( 8/ 10 ) ,对照组仅有肿瘤的局部生长和浸润 ,无转移发生 ;原位模型的小鼠平均生存期为 ( 11.0±2 .4)d较对照组 ( 2 3.0± 4.7)d明显缩短 ,差异有非常显著性 ( P <0 .0 1)。结论 小鼠的前列腺癌原位移植瘤模型较好地模拟了人癌体内的自然生长状况 ,是观察转移性前列腺癌较为适宜的模型。

Cx3cr1抗体玻璃体腔注射对视网膜缺血-再灌注损伤模型小鼠视网膜微循环的保护作用及其机制

目的探讨小胶质细胞活化抑制剂C-X3-C基序趋化因子受体1(cx3cr1)抗体玻璃体腔注射对视网膜缺血—再灌注损伤(RIR)过程中视网膜微循环的保护作用及其可能机制。方法采用随机数字表法将150只成年健康C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、模型组和cx3cr1抗体注射组,每组各50只。空白对照组小鼠仅玻璃体腔注射无菌注射用水2μl,模型组小鼠采用前房灌注升高眼压法建立RIR模型,cx3cr1抗体注射组小鼠玻璃体腔注射0.2μg/μl cx3cr1抗体2μl,注射后4 h建立RIR模型。于造模后3 d采用免疫荧光染色法检查各组小鼠实验眼冰冻切片中各层视网膜结构Iba-1阳性表达以评估小胶质细胞活化情况;采用视网膜铺片血管染色法观察视网膜深层和浅层血管密度变化及活化小胶质细胞数以评估视网膜微循环改变;采用FITC-dextran造影法测定视网膜血管渗漏面积;采用实时荧光定量PCR法测定视网膜中缺氧相关因子及炎性因子mRNA表达变化。结果眼球冰冻切片免疫荧光染色结果显示,空白对照组中Iba-1阳性小胶质细胞稀疏分布于视网膜神经节细胞层和内丛状层,呈分支形态;模型组Iba-1阳性细胞数量明显增多,呈阿米巴样或球形,并明显向外丛状层、外核层等视网膜外层移动;cx3cr1抗体注射组球形或阿米巴样的Iba-1阳性细胞数较模型组明显减少;模型组小鼠视网膜各层活化小胶质细胞数明显多于空白对照组和cx3cr1抗体注射组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较,cx3cr1抗体注射组小鼠视网膜血管周围活化小胶质细胞数量明显减少。视网膜铺片血管与活化小胶质细胞共染色结果显示,空白对照组和cx3cr1抗体注射组小鼠视网膜深层血管密度均明显高于模型组,cx3cr1抗体注射组浅层及深层视网膜血管周围小胶质细胞数量较模型组明显减少,差异均有统计学意义(均P<0.05)。空白对照组、模型组和cx3cr1抗体注射组血管相对渗漏率分别为(100.0±4.7)%、(162.1±10.6)%和(130.5±9.5)%,总体比较差异有统计学意义(F=128.66,P<0.01),cx3cr1抗体注射组小鼠视网膜血管相对渗漏率明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,与模型组比较,cx3cr1抗体注射组和空白对照组小鼠视网膜中血管内皮生长因子A(VEGF-A)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)mRNA相对表达量均明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论Cx3cr1抗体玻璃体腔注射可对RIR模型小鼠的视网膜微循环系统血管完整性发挥保护作用。

C57BL6近交系小鼠前列腺癌原位移植瘤模型建立及比较

目的探讨瘤丝注射法建立C57BL6前列腺癌原位移植瘤模型的应用价值,并与传统的前列腺原位癌成瘤方法进行比较。方法取36只7周龄(18~20 g)雄性C57BL6近交系小鼠,将其分成A、B、C 3组,每组12只,A组为瘤丝注射组、B组为细胞注射组、C组为肿块移植组。观察每组小鼠的成瘤情况、转移情况、周围组织浸润情况、小鼠生存期、操作难易程度等指标。结果A、B、C 3组小鼠成瘤率分别为100%、91.67%、91.67%,3组小鼠成瘤率比较差异无统计学意义(P>0.05)。A、B、C组小鼠肺转移率分别为83.33%、25.00%、33.33%,肝转移率分别为75.00%、25.00%、25.00%,A组小鼠的肺、肝转移率明显高于B、C组(P<0.05);B、C组小鼠的肺、肝转移率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组小鼠均出现广泛的腹腔浸润。A、B、C组小鼠的生存时间分别为(17.33±2.19)、(14.7±2.39)、(13.58±2.43)d,A组小鼠的生存时间明显长于B、C组(P<0.05);B、C组小鼠的生存时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。A组操作难度要求相对较低,B组成瘤方式易导致细胞液外溢造成人为肿瘤转移,对术者注射器持握的平稳性要求较高,C组需对前列腺筋膜进行缝合,要求术者具有较好的显微手术技术。结论相比于传统的成瘤方法,瘤丝注射法具有更高的成瘤率、转移率和更长的生存时间。

缺氧条件下自噬在视网膜血管内皮细胞血管生成中的作用

目的研究缺氧条件下自噬对体外培养的小鼠视网膜血管内皮细胞（RVECs）增生、迁移和管腔形成的影响。方法取清洁级C57BL/6J小鼠50只，采用组织块培养法分离和培养小鼠RVECs，采用CD34免疫荧光染色法对培养细胞进行鉴定。将生长良好的RVECs分为正常对照组、缺氧对照组及缺氧＋3-甲基腺嘌呤（3-MA）组。正常对照组细胞常规培养，缺氧对照组细胞在氧体积分数1%的环境下培养24 h，缺氧＋3-MA组细胞先用5 mmol/L 3-MA预处理4 h，然后在上述缺氧环境下培养24 h。采用Western blot法检测自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）比值及细胞中Beclin-1的表达；透射电子显微镜下观察细胞内形成的自噬小体的超微结构；分别采用Click-iT EdU试剂盒、细胞划痕法和Matrigel胶法检测细胞增生率、细胞迁移情况及细胞管腔形成情况。 结果原代培养后5～7 d培养的细胞呈铺路石样排列生长，CD34表达阳性。透射电子显微镜下缺氧对照组细胞自噬小体明显多于正常对照组和缺氧＋3-MA组。正常对照组、缺氧对照组和缺氧＋3-MA组细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别为0.243±0.030、0.658±0.032和0.405±0.095，Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.260±0.040、0.650±0.071和0.461±0.089；细胞增生率分别为（45.93±6.39）%、（22.74±2.35）%和（24.12±3.59）%；细胞划痕愈合率分别为（36.02±5.84）%、（57.26±11.98）%和（18.16±9.73）%；细胞管腔形成数分别为（29.20±6.10）、（41.40±4.04）和（22.00±2.92）个；总体比较差异均有统计学意义（F＝35.86、23.53、34.28、21.12、23.27，均P〈0.01）。与正常对照组相比，缺氧对照组细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相对表达均明显增加，细胞增生率明显下降，划痕愈合率和管腔形成数明显增加，缺氧＋3-MA组细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相对表达量、划痕愈合率和细胞管腔形成数较缺氧对照组明显降低。结论缺氧激活小鼠RVECs自噬，进而促进细胞迁移和管腔形成，自噬抑制剂3-MA可抑制自噬小体活性，并抑制RVECs的迁移和管腔形成能力。

小鼠闪烁光诱导眼视网膜中Egr-1基因的表达及作用

背景 闪烁光可以诱导轴性近视的发生,但是参与近视发生的机制尚不明确.早期生长反应基因（Egr-1）作为即早基因的一种,对视觉刺激反应灵敏,但其对近视发展的作用值得研究. 目的 探讨Egr-1基因在闪烁光诱导（FL）眼小鼠视网膜中的动态表达及意义,并与形觉剥夺（FD）眼对照.方法 采用随机数字表法将150只28日龄健康C57 BL/6J（B6）小鼠随机分为正常对照组、FD组和FL组.FD组小鼠使用半透明塑料眼罩遮盖右眼2周,而FL组小鼠用频率为2 Hz的闪烁光照射2周,以建立近视眼模型,然后2个组小鼠均在正常环境中喂养1周.分别于造模前、造模1h、1d、1周、2周时及造模后1周使用红外偏心验光仪和动物专用A型超声仪测量所有小鼠右眼的屈光度及眼轴长度.分别于造模前后各时间点任意处死各组10只小鼠,分离视网膜组织,分别采用Western blot法和免疫组织化学法检测Egr-1蛋白在小鼠视网膜中的相对表达量和定位,采用荧光免疫化学法检测小鼠视网膜中Egr-1标志物的表达,采用逆转录PCR（RT-PCR）法检测小鼠视网膜中Egr-1 mRNA的表达.结果 造模2周时,FL组小鼠的屈光度为（0.32±0.14）D,屈光度改变小于FD组小鼠的近视（-0.66±0.43）D,差异有统计学意义（t=6.78,P=0.00）.RT-PCR检测显示,造模1h时,FD组小鼠和FL组小鼠视网膜中Egr-1 mRNA的表达量分别为0.626±0.044和0.695±0.058,明显低于正常对照组的1.009±0.089,差异有统计学意义（t=14.81,P=0.01;t=9.15,P=0.03）,造模2周时均持续低于正常对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,而造模终止后1周FD组和FL组小鼠视网膜中Egr-1mRNA表达量明显高于正常对照组,差异有统计学意义（t=4.13,P=0.01;t=4.26,P=0.01）.Western blot检测显示,FD组和FL组小鼠视网膜中Egr-1蛋白相对表达量随造模后时间的延长逐渐下降,造模2周时最低,FD组比FL组下降更为明显,造模后1周Egr-1蛋白表达量升高,但仍低于正常对照组,差异均有统计学意义（t=6.32,P=0.00;t=5.45,P=0.01）.免疫组织化学检测显示,正常对照组Egr-1蛋白主要表达于视网膜神经节细胞层、内核层和感光细胞层,造模2周时FD组和FL组小鼠视网膜中Egr-1蛋白表达明显减弱,造模终止后1周Egr-1蛋白表达增强.免疫荧光检测显示,Egr-1标志物Neuron和蛋白激酶C（PKC）-α在正常小鼠神经节细胞和双极细胞均呈阳性表达.结论 FL诱导后小鼠眼屈光度向近视方向发展,视网膜中Egr-1基因的表达量随屈光度下降的程度而下调,这个动态变化过程与FD模型眼一致.

Toll样受体4对氧诱导视网膜新生血管发生的促进作用及其机制

背景研究发现，Toll样受体（TLRs）在视网膜新生血管的形成中发挥重要作用，但其作用机制尚不清楚。目的探讨TLR4对小鼠氧诱导视网膜病变（OIR）中新生血管生成的作用及其机制。方法将18只7日龄新生C57BL／6J小鼠以随机数字表法按小鼠窝别分为常氧组、OIR组及0IR＋脂多糖（LPS）-EB组，常氧组小鼠在正常氧环境中饲养，OIR组及OIR＋LPS—EB组小鼠于生后第7天（P7）与母鼠置于体积分数（75±2）％高氧氧箱中饲养5d以诱导OIR模型，于P12在正常氧环境中饲养，OIR＋LPS-EB组P12小鼠腹腔内注射LPS-EB，剂量为1mg／kg，OIR组同法注射PBS。各组摘取P17小鼠眼球于质量分数4％多聚甲醛中固定并行视网膜铺片和Lectin染色，计算视网膜无血管区和新生血管区面积占全视网膜的百分比。各组制备P17小鼠眼后节组织冰冻切片并行免疫荧光检测，计数小鼠5mm视网膜全长活化小胶质细胞数目；采用CDllb和TLR4免疫荧光双标记法检测各组小鼠视网膜小胶质细胞中CDllb、TLR4的表达及其分泌血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素1p（IL-1β）和肿瘤坏死因子-a（TNF-a）的水平。结果常氧组P17小鼠视网膜血管分布和形态正常，OIR组和OIR＋LPS—EB组P17小鼠视网膜中央均出现无血管区和新生血管簇，OIR＋LPS-EB组小鼠视网膜无血管区面积比为（18．47±1．32）％，新生血管面积比为（3．29±0．85）％，分别大于OIR组的（15．78±1．44）％和（1．77±0．19）％，差异均有统计学意义（t=3．36，P=0．01；t=4．22，P=0．00）。免疫荧光结果显示，常氧组P17小鼠视网膜中活化小胶质细胞数量极少，OIR组和OIR＋LPS—EB组P17小鼠视网膜中活化小胶质细胞荧光强度增强，活化小胶质细胞数量增加，其中OIR＋LPS-EB组小鼠视网膜中小胶质细胞数明显多于OIR组，差异有统计学意义[（95．50±4．77）／5mm与（74．83±4．17）／5mm，t=8．00，P〈0．01]。常氧组小鼠视网膜中TLR4阳性小胶质细胞数量极少，OIR组和OIR＋LPS—EB组小鼠视网膜中TLR4荧光增强，TLR4阳性小胶质细胞数量明显增加，OIR＋LPS—EB组小鼠视网膜中TLR4阳性小胶质细胞数目明显多于OIR组，差异有统计学意义[（49．50±6．38）／5mm与（28．17±6．24）／5mm，t=5．86，P〈0．01）]。常氧组P17小鼠视网膜中CDllb和VEGF／IL-1β／TNF-a共表达的小胶质细胞数量分别为（1．17±0．75）／5mm、0和0，而OIR＋LPS—EB组小鼠视网膜中共表达CDllb和VEGF／IL·1β／TNF—d的小胶质细胞数量多于OIR组，差异有统计学意义[（44．50±8．78）／5mm与（28．50±5．61）／5mm，F=44．07，P〈0．01；（24．10±6．49）／5mm与（16．00±3．46）／5nlm，F=11．31，P〈0．01；（33．83±14．82）／5mm与（23．00±2．83）／5mm，t=19．92，P〈0．01]。结论TLR4可促进OIR小鼠视网膜新生血管的生成，其作用机制可能与TLR4激活视网膜小胶质细胞中相关的下游信号通路，促进血管生长因子及炎性因子的释放有关。

艾拉莫德对肺纤维化小鼠肺组织的保护作用

目的观察艾拉莫德对肺纤维化小鼠肺脏的保护作用。方法将40只雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组和治疗组,每组20只。所有小鼠采用博来霉素3. 5 mg/kg进行气管滴注建立肺纤维化模型,治疗组大鼠于造模后第1 d用艾拉莫德混悬液50mg/(kg·d)灌胃进行治疗,每日1次,共持续28 d;对照组大鼠以同样的方法给予相应剂量PBS溶液。分别于治疗后7、14、21和28 d处死各组小鼠各5只,采用苏木精-伊红染色法观察小鼠肺组织炎症反应并进行炎症评分;采用Masson染色法观察肺组织纤维化改变并采用Ashcroft评分标准对肺纤维化程度进行评分。结果苏木精-伊红染色显示治疗组和对照组小鼠治疗后7和14 d肺组织和间质可见炎症细胞浸润,随着治疗时间延长治疗组小鼠肺间质炎性病变明显减轻,评分降低,对照组小鼠各时间点炎症评分均高于治疗组。Masson染色显示治疗后各时间点对照组小鼠肺间质纤维化程度均较治疗组严重,治疗第21和28天对照组小鼠Ashcroft纤维化评分分别为4. 96±0. 06和4. 92±0. 01,均明显高于治疗组的0. 70±0. 17和0. 75±0. 55,差异均有统计学意义(均P<0. 001)。结论艾拉莫德对肺纤维化小鼠有明显的治疗作用,可缓解肺纤维化程度并延迟肺纤维化进程。

氧诱导视网膜病变小鼠模型的蛋白表达谱分析

背景视网膜新生血管（RNV）是目前世界范围内主要的致盲原因之一，而目前的治疗效果并不理想，因此需要寻找在疾病状态下异常表达的蛋白质标志物，为新生血管性视网膜疾病的治疗提供新的靶点。目的观察氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型中视网膜血管的形态学特征，筛选并验证差异性表达的蛋白质分子。方法选取7日龄健康清洁级C57BL／6J幼鼠44只，分为OIR组和正常对照组。OIR组幼鼠先在氧体积分数为（75±2）％的环境下饲养5d，然后在正常空气环境中饲养5d，而正常对照组幼鼠仅在正常空气环境下饲养10d。取17日龄幼鼠经球后静脉注射高分子量异硫氰酸葡聚糖（FITC-dextran），然后制备视网膜铺片，观察视网膜血管的形态并统计视网膜无灌注区相对面积；取各组小鼠眼球行石蜡切片和苏木精一伊红染色，计数突破内界膜的血管内皮细胞核数；采用蛋白芯片法检测蛋白质分子在OIR组和正常对照组小鼠眼球中的差异性表达，并用Western blot法和ELISA法对差异表达蛋白进行验证。结果视网膜铺片结果显示，OIR组小鼠视网膜周边血管紊乱，静脉血管迂曲，视网膜中央有明显的无灌注区，在视网膜灌注区和无灌注区的交界处有大量新生血管芽，而正常对照组视网膜血管细密，静脉平滑，分布均匀整齐。OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积为（25．53±2．16）％，较正常组无灌注区的相对面积（0．66±0．36）％明显增加，差异有统计学意义（t=-27．61，P〈0．01）。石蜡切片苏木精-伊红染色结果表明，OIR组小鼠视网膜平均每张切片突人玻璃体腔的血管内皮细胞核数为（28．41±3．97）／切片，而正常组为（0．16±0．31）／切片，两组间比较差异有统计学意义（t=-54．42，P〈0．001）。蛋白芯片检测结果显示，在检测的62个与新生血管和炎症相关的细胞因子中，表达变化达1．5倍以上者10个，包括3个上调因子和7个下调因子；表达变化达2倍以上的细胞因子4个，包括3个下调因子和1个上调因子。对表达差异最显著的6个细胞因子（上调、下调各3个）进行Western blot和ELISA验证，结果表明血小板因子4（PF-4）、血管内皮生长因子A（VEGF—A）、P-选择素（SELP）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）、可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ（sTNF—RⅡ）以及趋化因子半胱氨酸-X-半胱氨酸基元配体16（CXCL16）的表达与蛋白芯片检测的表达趋势一致，其中PF-4、SELP和VEGF—A在OIR眼球中表达显著上调，CXCLl6、sTNF—RⅡ和VCAM-1在OIR眼球中的表达显著下调，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论本研究成功建立OIR小鼠模型。细胞因子PF-4、SELP、VEGF—A、CXCL16、sTNF—RⅡ和VCAM-1在OIR模型和正常对照小鼠的眼球组织中的表达存在显著差异，提示OIR状态下血小板系统处于激活状态，而促炎因子表达下调。PF-4可能成为针对RNV的VEGF非依赖型治疗策略的新靶点。

小鼠视觉发育前关键期视皮层神经元反应特性与突触可塑性

背景人类及哺乳动物的视觉发育主要是在生后关键期内完成的，但此期并非是哺乳动物接受视觉经验刺激的最早期。小鼠等哺乳动物视觉发育的关键期前还存在前关键期。目前，前关键期视皮层神经元的反应特性及突触可塑性研究仍处于探索阶段。目的探讨小鼠前关键期视皮层神经元的反应特性及突触可塑性特点。方法选择生后13～17d的C57BL／6J小鼠48只，分别采用在体膜片钳全细胞记录及离体脑片膜片钳全细胞记录法记录小鼠视皮层第Ⅳ层神经元的电生理反应。在体记录在小鼠麻醉下进行，在电流钳模式下给予步阶电流刺激，测量其在体膜反应特性。给予最优刺激参数的移动光棒刺激，测量其视觉诱发反应特性。完成在体实验后行离体实验，分别测量神经元离体膜反应特性及白质-第Ⅳ层通路刺激条件下的诱发反应特性。采用随机数字表法将实验动物随机分成4个组，各组雌雄比例分配均匀。每组测定12个细胞，按照刺激频率的不同分别行低频刺激（LFS）和高频刺激[0波脉冲刺激（TBS）]模式训练，按照刺激时序的不同进行突触前一后（pre-post）模式和突触后-前（post—pre）模式训练，在-70mV电压钳制下分别记录训练前后兴奋性突触后电流（EPSCs）。采用pClmap10软件对原始数据进行预处理，采用Matlab2008a软件进行统计分析。结果在体成功记录的细胞数为39个，离体记录48个。在体和离体条件下视皮层第Ⅳ层神经元稳态平均发放动作电位（AP）个数分别为1．01±0．03和1．01±0．05，AP阈值分别为（-40．2±3．2）mV和（-39．6＋2．0）mV，阈电流水平分别为（126．7±17．4）pA和（129．6±17．5）pA，差异均无统计学意义（AP数：t=0．512，P=0．610；AP阈值：t=-1．074，P=0．286；阈电流：t=-0．776，P=0．440）。在体最优视觉刺激条件下平均膜电位峰值幅度为（7．3±4．3）mV，鲜见AP；离体最强通路刺激条件下平均膜电位峰值反应幅度为（6．4±2．8）mV，未见AP，在体与离体记录的平均膜电位峰值幅度差异无统计学意义（t=1．234，P=0．221）。离体条件下，LFS训练前后EPSCs幅度分别为（138．1±51．9）pA和（76．1±34．8）pA，差异有统计学意义（t=4．437，P=0．001），而TBS训练前后EPSCs幅度差异无统计学意义（t=-0．756，P=0．466），pre—post训练前后EPSCs幅度分别为（122．4±62．2）pA和（78．55±46．7）pA，postpre训练前后分别为（131．9±48．0）pA和（74．35±30．7）pA，差异均有统计学意义（pre—post：t=3．558，P=0．004；post—pre：t=4．283，P=0．001）。结论前关键期小鼠视皮层第Ⅳ层已完成神经回路的基本构建，但神经元的膜反应性以及突触连接仍未成熟。在低频或高频突触前后时序差异性输入条件下，突触功能受到抑制，而在高频输入条件下突触功能得到继续保持。前关键期小鼠视觉神经系统的发育具有不同于关键期的特征。

伏立康唑纳米银复合膜对烟曲霉菌性角膜炎的疗效及安全性

背景 伏立康唑具有良好的抗真菌活性,但目前临床上所用剂型的生物利用度并不理想.改良伏立康唑眼用剂型并提高药物的生物利用度对于改善真菌性角膜炎的预后,减少药物不良反应具有重要意义. 目的 研究伏立康唑纳米银/聚合物复合材料在治疗真菌性角膜炎过程中的缓释作用、药物疗效和安全性.方法 选择6～8周龄雌性SPF级C57BL/6小鼠210只,其中30只用于药物的生物相容性验证,180 只小鼠用于疗效观察,均以左眼作为实验眼.药物的生物相容性研究中将30只小鼠按照随机数字表法分为正常对照组、纳米银/羧基石墨烯/壳聚糖季铵盐复合物（CS-ETA/Ag/GO）组和包被伏立康唑的纳米银/羧基石墨烯/壳聚糖季铵盐复合物（CS-ETA/Ag/GO/Vor）组,分别将自行构建的CS-ETA/Ag/GO膜和CS-ETA/Ag/GO/Vor膜贴敷于小鼠左眼角膜,分别于贴敷后1d、7d行角膜组织的常规组织病理学检查.药物疗效观察实验中,应用随机数字表法将180只小鼠随机分为模型对照组、CS-ETA/Ag/GO组和CS-ETA/Ag/GO/Vor组.3个组小鼠均用33G注射器针头于左眼角膜基质内注射5＆#215;107 CFU/ml烟曲霉菌悬浮液2.0μl建立烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型,CS-ETA/Ag/GO组和CS-ETA/Ag/GO/Vor组小鼠分别在模型眼角膜贴敷相应的药膜.分别于造模后第1、3、5、7天用裂隙灯显微镜对术眼角膜炎症进行评分及组织病理学检查,采用真菌平板并计算角膜载菌量;采用real-time PCR法检测角膜组织中炎性因子TNF-α mRNA和IL-1β mRNA的相对表达量.结果 CS-ETA/Ag/GO膜和CS-ETA/Ag/GO/Vor膜贴敷于正常小鼠角膜后1～7d,经组织病理学检查均未见异常.CS-ETA/Ag/GO/Vor组各时间点小鼠的角膜炎症评分明显低于模型对照组和CS-ETA/Ag/GO组,3个组间和不同时间点角膜炎症评分的总体差异均有统计学意义（F分组=237.29,P=0.00;F时间=260.33,P=0.00）.角膜组织病理学检查显示,模型对照组小鼠角膜水肿,部分角膜基质溶解坏死,第7天部分小鼠角膜穿孔.CS-ETA/Ag/GO组于造模后角膜炎症表现轻于模型对照组,随造模后时间的延长,角膜炎症逐渐减轻,而各个时间点CS-ETA/Ag/GO/Vor组小鼠角膜炎症反应最为轻微,造模后第7天角膜炎症接近痊愈.造模后CS-ETA/Ag/GO/Vor组小鼠角膜载菌量最低,且随着时间延长,载菌量逐渐减少,各组不同时间点角膜载菌量的总体差异比较差异均有统计学意义（F分组=113.15,P=0.00;F时间=126.52,P=0.00）.CS-ETA/Ag/GO/Vor组小鼠角膜中IL-1β mRNA和TNF-α mRNA相对表达量均明显低于模型对照组和CS-ETA/Ag/GO组,其相对表达量均于造模后第5天达峰,第7天明显下降.3个组间小鼠在造模后不同时间点角膜中相对表达量的差异均有统计学意义（IL-1β：F分组=189.90,P=0.00;F时间=108.56,P=0.00;TNF-α：F分组=82.55,P=0.00;F时间=44.36,P=0.00）. 结论 CS-ETA/Ag/GO/Vor药物缓释膜通过伏立康唑和银离子的协同作用共同抑制真菌活性,减轻真菌诱导的角膜炎症反应.CS-ETA/Ag/GO/Vor药物缓释膜贴敷于角膜后生物相容性好,未发现角膜组织的毒性反应.

白细胞介素-6对糖尿病小鼠角膜缘干细胞活化的促进作用和角膜上皮愈合的加速作用

背景白细胞介素（IL）-6既介导炎症反应过程又在损伤修复中发挥重要作用，但其具体机制及其在糖尿病角膜组织损伤修复中的作用值得探讨。目的探讨IL-6在正常和糖尿病小鼠角膜缘干细胞活化和角膜上皮修复过程中的作用及其机制。方法正常6～8周龄C57BL/6小鼠52只，采用随机数字表法随机分为正常对照鼠32只和糖尿病模型鼠20只，采用50 mg/kg链脲佐菌素连续腹腔内注射5 d的方法诱导建立小鼠糖尿病模型。正常对照小鼠和糖尿病模型小鼠均行角膜上皮刮除术，然后分别于刮除后即刻和48 h结膜下注射IL-6或等容量PBS，采用荧光素染色法评价随时间延长的角膜上皮的愈合情况。体外培养小鼠角膜上皮干/祖细胞（TKE2细胞系），采用结晶紫染色法评估不同质量浓度IL-6处理后细胞克隆率（CFE），并与空白对照组进行比较；采用免疫荧光检测法和Western blot法检测细胞和小鼠再生上皮中干细胞标志物ΔNP63、Ki67的表达以及关键转录因子STAT3磷酸化水平；采用实时荧光定量PCR法和ELISA法检测小鼠角膜再生上皮中IL-6的mRNA及蛋白水平。结果角膜荧光素染色检查显示，正常对照小鼠和糖尿病模型小鼠PBS注射组与IL-6注射组注射后24、48和72 h残留角膜上皮缺损面积占原始缺损面积的百分比随角膜上皮损伤后时间延长均明显缩小，同时间点IL-6注射组角膜上皮缺损面积均明显小于PBS注射组，组间总体差异均有统计学意义（正常对照组：F分组＝19.982，P〈0.01；F时间＝589.350，P〈0.01；糖尿病组：F分组＝25.411，P〈0.01；F时间＝334.807，P〈0.01）。空白对照组及10、20、50、100 ng/ml IL-6处理组CFE分别为（13.23±1.12）%、（15.87±1.30）%、（21.69±1.62）%、（25.33±1.28）%和（18.67±1.54）%，随着IL-6质量浓度的增加CFE逐渐增加，总体比较差异有统计学意义（F＝35.547，P〈0.01）。50 ng/ml IL-6处理5、10、15、30和60 min细胞中ΔNP63、Ki67和p-STAT3蛋白的相对表达量随着处理时间的延长均逐渐增加，各时间点细胞中ΔNP63、Ki67和p-STAT3蛋白的相对表达量均明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。糖尿病组和正常对照组小鼠角膜上皮刮除后24 h的再生上皮中IL-6 mRNA相对表达量分别为0.45±0.21和1.00±0.16，糖尿病组小鼠角膜再生上皮中IL-6 mRNA相对表达量较正常对照组小鼠下降56%，差异有统计学意义（t＝3.42，P＝0.03），糖尿病小鼠角膜上皮刮除后48 h的再生上皮中IL-6蛋白质量浓度为（257±12）ng/μl，明显低于正常对照组小鼠的（323±17）ng/μl，差异有统计学意义（t＝5.60，P〈0.01）。结论IL-6能够通过激活STAT3信号通路促进正常和糖尿病小鼠角膜缘干细胞的活化和增生，进而促进角膜上皮修复，而封闭内源性IL-6则会延迟小鼠角膜上皮的修复。

γδT细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠脾脏中的动态表达及作用机制

背景以往研究证明葡萄膜炎的发病机制与γδT细胞相关，18T细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）中的作用尚不完全清楚。目的研究γδT细胞在EAU小鼠脾脏中的动态变化，探讨γδT细胞在EAU病程进展中的作用机制。方法应用随机数字表法将45只C57BL／6（B6）小鼠随机分为正常对照组6只和模型组39只。用抗原肽光感受器间维生素A类结合蛋白1-20（IRBP1-20）及完全弗氏佐剂（CFA）的乳化液在B6小鼠的足垫、尾根部及躯干部均匀注射6个点，用Genesis-D动物眼部照相机观察并记录正常小鼠及免疫后不同时间点（4、8、12、16、20、24、28、32和36d）EAU小鼠的发病情况，参照Thurau的评分标准进行炎症评分。颈椎脱臼法处死小鼠后摘取右侧眼球，切片后行组织病理学评分。同时在相同时间点分离模型小鼠脾脏淋巴细胞，流式细胞仪检测18T细胞数量和激活状态。免疫磁珠分选18T细胞，并用流式细胞仪检测其细胞内表达白细胞介素-17A（IL-17A）的变化。向EAU小鼠回输激活的18T细胞，观察炎症变化。结果经IRBP1-20及CFA乳化液免疫后小鼠于第12天可见轻度葡萄膜炎症，炎症反应在免疫后第16-20d达峰，至第28天炎症明显减轻。组织病理学观察发现，免疫小鼠视网膜外核层皱褶，玻璃体、视网膜全层炎性细胞浸润及内界膜层增厚。造模后不同时间点的炎症症状评分和病理学炎症评分的总体比较，差异均有统计学意义（F=51．399，P=0．000；F=47．342，P=0．000）。流式细胞仪检测发现，EAU发病高峰期小鼠的脾脏中γδT细胞数量增加，造模后16d和20d分别为（5．67±0．49）％和（5．78±0．55）％，与造模前的（1．53±0．14）％比较，差异均有统计学意义（均P〈0．05），且呈活化状态。EAU发病高峰期小鼠的脾脏中18T细胞分泌的IL-17A明显增多，造模后16d和20d分别为（13．40±0．50）％和（17．80±2．37）％，与正常对照小鼠的（1．53±0．19）％比较，差异均有统计学意义（P=0．000、0．001）。体内回输激活的γδT细胞后EAU炎症加重，炎症症状评分为1．00（1．00，2．00），明显高于未回输激活的γδT细胞的0．75（0．05，1．00），二者比较差异有统计学意义（Z=27．00，P=0．03）。结论EAU中γδT细胞比例在炎症的高峰期明显升高，且呈激活状态；活化性γδT细胞在EAU模型中发挥的免疫调节作用可能是通过分泌IL-17A进行的。

实验性脉络膜新生血管形成过程中巨噬细胞及单核细胞趋化蛋白-1的作用

背景脉络膜新生血管（CNV）是多种眼底疾病造成视力损害的的主要原因之一。近年来的研究发现单核细胞来源的巨噬细胞（F4／80）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）在CNV的形成过程中发挥作用，但它们在新生血管发生早期的动态表达及机制仍不明确。目的观察CNV模型小鼠在CNV发展早期局部组织中巨噬细胞和MCP-1表达的动态变化。方法SPF级8周龄雄性野生C57BL／6小鼠105只，用氪离子激光仪对小鼠的任意一侧眼在距视盘2～3倍视盘直径处的3：00、6：00、9：00和12：00方位进行激光光凝以建立CNV动物模型。按照随机数字表法将CNV小鼠模型随机分不同时间点组，分别于光凝后6、12、24、48和72h各处死小鼠，摘取眼球组织后制备眼球壁组织切片、脉络膜铺片和视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜复合体切片，采用苏木精-伊红染色，观察视网膜光凝后眼球壁各层的组织病理学改变和炎症反应情况；采用免疫荧光双标记技术测定小鼠视网膜-脉络膜组织中F4／80和MCP-1的表达和分布；采用免疫荧光技术检测小鼠脉络膜铺片中F4／80的表达和分布；采用实时荧光定量PCR技术检测小鼠RPE-脉络膜组织中F4／80mRNA的相对表达量；采用ELISA法定量检测小鼠RPE-脉络膜组织中MCP-1质量分数。以光凝后6h组小鼠非实验眼作为正常对照。结果视网膜光凝后6h光学显微镜下可见光凝区Brueh膜、RPE层和脉络膜层均破裂，视网膜外核层连续性中断，随着光凝后时间的延长，可见局部炎症细胞浸润和组织水肿，光凝后72h可见光凝区边缘出现血管内皮细胞增生。光凝后6h可见光凝区RPE及脉络膜组织中F4／80表达，周围组织中可见MCP-1表达，随着光凝后时间延长MCP-1表达强度减弱，而F4／80表达仍增强。正常对照组及光凝后6、12、24、48和72h组RPE-脉络膜复合体中MCP-1蛋白的质量分数分别为（31．25±4．73）、（276．31±4．20）、（331．95±5．86）、（221．24±4．42）、（179．89±4．10）和（130．80±5．90）pg／mg，总体比较差异有统计学意义（F=1416．46，P=0．00），光凝后12h其质量分数达峰值，之后逐渐下降，但光凝后各时间组MCP-1蛋白的质量分数均明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。各组RPE-脉络膜复合体中174／80mRNA的相对表达量总体比较差异有统计学意义（F=762．72，P=0．00），光凝后随着时间延长F4／80mRNA的相对表达量逐渐升高，与正常对照组比较差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论实验性CNV形成早期伴随着明显的炎症反应，趋化因子MCP-1主要在CNV形成的起始阶段发挥作用，而巨噬细胞的聚积和活化在CNV形成和发展过程中起促进作用。

小鼠经角膜视网膜下腔注射的方法学研究

背景 小鼠是眼科基因治疗、干细胞移植和眼底病研究的常用动物模型,视网膜下腔注射是上述研究中常用的实验技术,该技术的操作流程对研究的结果产生较大影响,但是目前对具体的视网膜下腔注射操作方法的介绍鲜见报道. 目的 观察小鼠经角膜视网膜下腔注射对视网膜形态和功能的影响. 方法 2月龄SPF级C57 BL/6J小鼠充分扩瞳后,在眼科专用手术显微镜下用301/2G一次性注射针头在角巩膜缘内侧穿刺小鼠右眼角膜,用带有33G平针头的微量进样器沿穿刺口进入并绕过晶状体后到达玻璃体,然后逐渐进针至视网膜下腔隙,缓慢推注1μl质量分数0.1％荧光素钠生理盐水注射液.根据注射后注射液在视网膜下腔的分布范围不同将实验眼分为80％～100％范围组和50％～70％范围组,模拟操作组以相同的方向进针至视网膜下腔但不注射溶液,小鼠的对侧眼（右眼）作为正常对照组,每组4只眼.分别于注射后1、2、3d及注射后5周光学相干断层扫描（OCT）法观察各组小鼠视网膜的形态结构变化;于注射后5周时记录各组小鼠的视网膜电图（ERG）,然后制备小鼠视网膜石蜡切片,采用苏木精-伊红染色观察各组小鼠视网膜的组织病理学改变. 结果 注射眼注射后视网膜绿色荧光范围＞50％且无明显并发症者为注射成功,成功率＞70％.OCT观察显示,注射后1d可见注射区域视网膜神经层与视网膜色素上皮（RPE）层脱离,局部视网膜隆起,注射后2d注射区域视网膜复位.注射后5周,模拟操作组、50％～ 70％范围组、80％～100％范围组和正常对照组小鼠ERG b波振幅分别为（386.25±37.88）、（357.50±41.03）、（324.25±53.45）和（410.50±14.88） μV,4个组间总体比较差异有统计学意义（F=3.574,P=0.047）,正常对照组ERG b波振幅明显高于80％ ～ 100％范围组（均P＜0.05）.组织病理学检查显示,模拟操作组、50％～ 70％范围组和80％～100％范围组小鼠神经层与R PE层分离,视网膜外核层细胞增生和移位,其中50％ ～ 70％范围组和80％～100％范围组小鼠注射点周围区域视细胞外节排列紊乱.各组小鼠未注射区域视网膜各层结构均正常.结论 经角膜视网膜下腔注射法是一种安全、可行的操作方法.

蓝光照射对小鼠视网膜形态和功能的损伤作用

目的通过观察蓝光照射对C57BL/6J小鼠视网膜形态和功能的影响,探讨非渗出性年龄相关性黄斑变性(AMD)的模型。方法采用投币法将20只8周龄清洁级C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常对照组和蓝光照射组。蓝光照射组小鼠暗适应24 h后暴露于10000 lx蓝光下5 d,正常对照组小鼠按12 h/12 h正常光照/黑暗的周期饲养于正常光照环境5 d。采用光相干断层扫描成像(OCT)活体检查各组小鼠视网膜厚度变化,采用视网膜电图(ERG)检查各组小鼠视网膜功能变化。于光照结束后24 h采用颈椎脱臼法处死小鼠并制备眼球壁标本,采用免疫荧光染色法测定小鼠视网膜中视紫红质(Rho)、紧密连接蛋白(ZO-1)和β-catenin蛋白表达。结果蓝光照射组小鼠视网膜上部和下部距视盘200、400、600、800和1000μm处视网膜外核层厚度均较正常对照组变薄,差异均有统计学意义(均P<0.05)。蓝光照射组小鼠暗适应和明适应b波振幅分别为(305.50±41.52)μV和(119.50±6.67)μV,分别低于正常对照组的(415.50±28.77)μV和(139.75±8.26)μV,差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常对照组小鼠RPE细胞呈正六边形,视网膜各层形态规则,Rho、ZO-1和β-catenin荧光较强;蓝光照射组小鼠RPE细胞形态不规则,ZO-1染色减弱或消失,β-catenin染色和Rho蛋白荧光强度减弱。结论蓝光照射小鼠视网膜变薄,视网膜功能减弱。

Radixin shRNA对高氧诱导的小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用

背景视网膜新生血管性疾病是多种眼科疾病的病理基础，迄今为止新生血管形成的发病机制尚不完全清楚。研究显示，视网膜新生血管形成过程中radixin表达量明显增加，因此推测在视网膜新生血管相关疾病中抑制或沉默radixin基因有望成为治疗的新方法。目的研究radixin小发卡（shRNA）干扰质粒对氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型视网膜中radixin基因表达的抑制作用，观察其对小鼠视网膜新生管形成的影响。方法将64只出生后7d的SPF级C57BL／6J小鼠按照随机数字表法分为正常对照组、模型对照组、radixin shRNA质粒组和shRNA质粒组，其中模型对照组、radixin shRNA质粒组和shRNA质粒组小鼠在体积分数（75±2）％的氧环境中饲养5d，建立OIR动物模型，正常对照组小鼠饲养于正常氧环境下。radixin shRNA质粒组和shRNA质粒组小鼠于出生后第12天分别于玻璃体腔注射1μg radixin shRNA质粒和对照shRNA质粒，小鼠出生后第17天，对各组小鼠行FD-2000S血管造影术，制备视网膜铺片，观察视网膜血管形态和分布；摘取各组小鼠眼球制备视网膜切片，采用视网膜苏木精－伊红染色法观察突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核和新生血管；应用免疫组织化学染色法检测radixin在视网膜中的表达分布；分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测radixin mRNA及其蛋白在视网膜组织中的表达情况。结果正常对照组小鼠视网膜铺片显示视网膜血管走行正常，模型对照组小鼠视网膜后极部大片状无灌注区，可见大血管迂曲和血管壁荧光素渗漏和新生血管，shRNA质粒组小鼠视网膜可见无灌注区和微血管瘤，而radixin shRNA质粒组小鼠视网膜后极部无灌注区面积较小，血管迂曲和渗漏现象较模型对照组和shRNA质粒组明显减轻。视网膜组织病理学检查显示，模型对照组和shRNA质粒组小鼠视网膜内界膜不连续，可见大量血管内皮细胞核和血管管腔突破内界膜，radixin shRNA质粒组视网膜内界膜形态接近正常对照组，有少量血管内皮细胞核和血管管腔突破内界膜。免疫组织化学检查显示，正常对照组和radixin shRNA质粒组radixin表达弱于模型对照组和shRNA质粒组。正常对照组、模型对照组、radixin shRNA质粒组和shRNA质粒组小鼠视网膜中radixinmRNA的相对表达量分别为1．002±0．043，2．236±0．093，0．556±0.015和2．272±0．096，各组间总体比较差异有统计学意义（F=504．545，P＝0．000）。正常对照组、模型对照组、radixin shRNA质粒组和shRNA质粒组小鼠视网膜中radixin蛋白的相对表达量分别为1．000±0．082、1．193±0．021、0．263±0．016和1．235±0．005，各组间总体比较差异有统计学意义（F=753．522，P=0．000）radixin shRNA质粒组radixin mRNA和蛋白的相对表达量较模型对照组和shRNA质粒组明显减低，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论Radixin shRNA能有效沉默OIR动物模型视网膜中radixin基因的表达，抑制视网膜新生血管的形成。

ResolvinE1对高危角膜移植免疫排斥反应的抑制作用

背景 以往防治角膜移植术后排斥反应的药物存在诱发局部或全身不良反应的风险，研究表明resolvinE1（RvE1）能够调节辅助性T细胞1（Th1）型免疫反应，但其对高危角膜移植术后的植片排斥反应有无抑制作用尚不清楚。目的观察高危角膜移植动物模型局部应用RvE1对植片免疫排斥反应的抑制作用。方法 以BALB/c小鼠为受体、C57BL/6小鼠为供体行角膜移植术。采用随机数字表法将90只BALB/c小鼠随机分成异体角膜移植组、异体角膜移植＋RvE1组和自体角膜移植组，每组各30只。BALB/c小鼠右眼先用缝线法刺激2周以建立高危角膜移植眼模型，然后行穿透角膜移植术。异体角膜移植组和异体角膜移植＋RvE1组小鼠右眼行异体角膜移植，自体角膜移植组小鼠将右眼角膜植片旋转180°后缝合于植床上。异体角膜移植组及自体角膜移植组小鼠术后每日用生理盐水10 μl结膜下注射1次，异体角膜移植＋RvE1组小鼠术后同法注射终质量浓度为0.1 μg/μl的RvE1 10 μl，连续7 d。术后裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜植片反应并对其排斥反应进行评分。术后21 d处死各组小鼠各20只，收集小鼠术眼角膜、眼球和术眼侧颈部淋巴结，采用苏木精－伊红染色法观察各组小鼠角膜植片的组织病理学变化；采用免疫组织化学法检测术眼角膜中CD4及γ干扰素（IFN-γ）的表达；采用流式细胞术检测术眼侧颈部淋巴结淋巴细胞中Th1细胞（CD3＋CD8a－IFN-γ＋）比例；采用荧光定量PCR法检测Th1细胞相关因子白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IFN-γ及T-bet mRNA的相对表达水平。结果 异体角膜移植＋RvE1组小鼠角膜植片存活时间为（28.5±1.7）d，明显长于异体角膜移植组的（14.0±1.6）d，差异有统计学意义（t＝4.14，P〈0.001），自体角膜移植组小鼠植片在术后50 d存活率为100%。苏木精－伊红染色显示，异体角膜移植＋RvE1组和自体角膜移植组小鼠角膜植片水肿及炎性细胞浸润程度均轻于异体角膜移植组。免疫组织化学法检测显示，各组角膜全层均有CD4表达，而IFN-γ主要表达于角膜上皮层，异体角膜移植组小鼠角膜组织中CD4和IFN-γ阳性细胞数均明显多于异体角膜移植＋RvE1组和自体角膜移植组。流式细胞术检测显示，异体角膜移植＋RvE1组和自体角膜移植组小鼠淋巴细胞中Th1细胞比例分别为（1.07±0.25）%和（0.85±0.12）%，明显低于异体角膜移植组的（1.56±0.20）%，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。荧光定量PCR检测显示，异体角膜移植组小鼠角膜中IL-2、TNF-α、IFN-γ及T-bet mRNA的相对表达量明显高于异体角膜移植＋RvE1组和自体角膜移植组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论 RvE1可抑制小鼠高危角膜移植排斥反应，作用机制可能与其下调角膜植片和淋巴细胞中Th1细胞及相关细胞因子的表达有关。