近平滑假丝酵母ATCC7330均质破碎工艺研究

研究了近平滑假丝酵母ATCC7330的高压均质破碎工艺,利用正交试验考查了均质温度、酵母质量分数、均质压力和均质次数对酵母细胞破碎得到的酮基还原酶的酶活影响。结果表明,4个因素的影响大小依次为均质压力>酵母质量分数>均质温度>均质次数,其中均质压力为近平滑假丝酵母破碎的显著性因素,最佳破碎工艺为均质温度6℃,酵母质量分数20%,均质压力180MPa,均质次数为3次。经过验证试验,采用高压均质破碎酵母细胞的方法可得到粗酶液酶活1.572U/mL,比优化前提高150%以上。

近平滑假丝酵母ATCC 7330的生长条件优化

通过单因素实验和正交实验,对近平滑假丝酵母ATCC 7330生长的营养元素和发酵条件进行了优化。结果表明,近平滑假丝酵母ATCC 7330生长的最优培养基配方为:MgSO_40.8g·L^(-1)、(NH_4)_2HPO_4 16g·L^(-1)、蔗糖25.98g·L^(-1)、酵母浸粉12g·L^(-1),最适发酵初始pH值为5.0,最适通风量为3.0L·min^(-1),在此条件下,菌体量比优化前提高110%。该研究为近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞催化应用奠定了基础。

近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶CpCR的表达及酶学性质研究

通过构建重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pACYC Duet-1-cpcr,表达带有His标签的近平滑假丝酵母Candida parapsilosis ATCC 7330羰基还原酶CpCR基因,并采用Ni-Agarose亲和层析对重组酶CpCR进行分离纯化和酶学性质研究。重组酶CpCR的基因序列全长1107 bp,含有368个氨基酸,分子质量在41 kDa左右,比酶活力为20 U/mg;该酶在4~33℃的温度范围稳定性较好,相对酶活力在80%以上,T 50值为37℃;该酶的pH适宜范围在6.2~7.5,在中性条件下稳定性最好;Cu^2+对该酶有强烈的抑制作用,在1 mmol/L条件下,相对酶活力下降30%,在5 mmol/L条件下,相对酶活下降50%;该酶对底物苯甲醛、正丁醛亲和能力强于4-氯-3-酮基-丁酸乙酯(4-chlor-3-keto-butyrate-ethyl ester,COBE),对苯甲醛或正丁醛的催化效率是对COBE的20倍左右;该酶是一种NADPH依赖型的羰基还原酶。本研究为羰基还原酶CpCR分子改造和催化应用提供了重要的基础数据。

近平滑假丝酵母ATCC 7330中羰基还原酶双水相萃取工艺研究

研究了聚乙二醇(PEG)/硫酸铵[(NH4)2SO4]双水相体系萃取近平滑假丝酵母ATCC 7330粗酶液中羰基还原酶的工艺,考察了无机盐种类、PEG分子量及其质量分数、(NH4)2SO4质量分数、萃取温度、萃取时间等因素对羰基还原酶纯化倍数的影响。确定最优的双水相萃取条件为:(NH4)2SO4质量分数15%、PEG1000质量分数19%、萃取温度16℃、萃取时间15 min,在此条件下,羰基还原酶的纯化倍数可达6倍。为近平滑假丝酵母ATCC 7330中羰基还原酶在手性化合物的绿色合成中的应用奠定了基础。

近平滑假丝酵母ATCC 7330对不同取代基乙酮类底物的催化效果

通过对接模拟和催化转化实验研究了近平滑假丝酵母ATCC 7330对10种不同取代基乙酮类底物的催化效果。结果表明:近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞催化对芳环取代乙酮类底物的光学选择性优于脂环取代乙酮类底物,对氨基苯乙酮的光学选择性最高,与模拟对接预测的结合能大小一致;从催化剂周转数来看,近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞对10种不同取代基乙酮类底物的催化能力大小依次为对氯苯乙酮=邻氯苯乙酮>1-萘乙酮>对氨基苯乙酮>环戊基乙酮>环己基乙酮>邻氨基苯乙酮>1-(1H-茚-4-基)乙酮>苯乙酮>环丙基乙酮,与对接模拟预测有一定差距。说明近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞的催化能力除了与结合能有关外,还与细胞的渗透性、反应溶剂等因素有关。

近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶CpCR突变体酶的稳定性研究

通过蛋白质理性设计和定点突变技术,在近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶wtCpCR的基础上,构建5个突变体酶A98N、S307N、G262N、S216N和S258N,考察了有机溶剂、温度、剪切力、氧气、辅酶NADPH浓度对突变体酶的稳定性影响。研究表明,A98 N在磷酸盐(potassium phosphate,PB)缓冲溶液中比酶活力提高10%,而S307 N没有酶活力,其他3个突变体比酶活力均有降低;A98 N和G262 N在PB/甲基叔丁基醚的双相体系中界面稳定性比原始酶wtCpCR分别提高1.7和1.4倍;4个突变体酶的耐热特性略有下降,T_(50)值介于31~36℃;在100、200 r/min条件下,4个突变体耐剪切力均增强,在300 r/min条件下G262 N突变酶的耐剪切稳定性比wtCpCR增强1.3倍;G262 N突变酶在有氧条件下的稳定性更好,比野生酶提高1.4倍,半衰期(t_(1/2))达到11.87 h;辅酶浓度为0~0.4 mmol/L时,G262 N突变酶更加稳定。该研究为该羰基还原酶wtCpCR的多点突变进一步改善酶稳定性提供重要的科学依据,同时可提高该酶在双相体系生物催化工艺的经济性。

近平滑假丝酵母细胞催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应

采用近平滑假丝酵母细胞用于催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应,可高选择性地生成(R)-1-三甲基硅乙醇.结果表明,固定化于海藻酸钙的细胞催化该反应的产物收率比游离细胞的高.不同辅底物对该反应的影响显著,以葡萄糖为辅底物时,反应的初速率较快,产物收率较高.该反应的最适条件为:辅底物(葡萄糖)浓度110mmol/L,振荡速度180r/min,缓冲液pH值6.0,反应温度30oC,底物浓度20mmol/L.在此反应条件下反应的初速率、产物收率和产物的ee值分别为11.4μmol/h,96.5%和99.9%.

木糖辅助底物对近平滑假丝酵母催化(R,S)-苯基乙二醇不对称氧化还原合成(S)-苯基乙二醇体系稳定性的促进作用

通过分析近平滑假丝酵母Candida parapsilosis催化外消旋苯基乙二醇（PED）不对称氧化还原合成（S）-苯基乙二醇的反应过程,结合微生物中糖类的代谢路径研究,建立了一种以木糖为辅助底物的NADPH辅酶再生的方法,提高了该催化系统的稳定性.结果表明,相同条件下反应体系中添加8 g/L的木糖可使（S）-PED产物的对映体过量值（ee）和产率分别提高14%和10%;菌体可重复使用3-4次,而产物ee值保持在98%.考察了木糖对表达羰基还原酶重组大肠杆菌体系催化效果的影响,发现木糖是通过强化（S）-羰基还原酶的催化作用提高了催化系统的稳定性,其原因是在磷酸戊糖途径中再生了氧化还原反应所需的NADPH辅酶.

近平滑假丝酵母NAD(H)依赖型次级醇脱氢酶的分离纯化及酶学性质

从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC 203011)中分离得到了NAD(H)依赖型的次级醇脱氢酶.粗酶经乙醇沉淀、Blue Sepharose Fast Flow亲和层析、DEAE Sepharose离子交换层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,其酶蛋白的亚基分子量(Mr)为37.5×103.该酶还原反应的最适pH为6.0,最适温度为45℃,是一个含Zn2+金属酶.该脱氢酶具有较高的底物的选择性,对2-酮具有较高的还原活力;同时,也能作用于醇类发生氧化反应,对次级醇的氧化活力最高.以β-羟基苯乙酮为底物,用纯化得到的酶催化反应后,还原产物为(R)-苯基乙二醇,因此该酶为(R)-专一性次级醇脱氢酶,是一种生产(R)-苯基乙二醇的有效的生物催化剂.经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中3个肽段的氨基酸序列,通过比对发现该酶与NCBI编号为BAA24528的次级醇脱氢酶具有较高的同源性.

人工瓣膜置换术后近平滑假丝酵母菌心内膜炎的临床特点及治疗(附1例报告)

目的总结人工瓣膜置换术后近平滑假丝酵母菌心内膜炎的临床特点,探讨其有效治疗方法。方法对1例人工瓣膜置换术后近平滑假丝酵母菌心内膜炎患者的临床资料进行回顾性分析。结果该近平滑假丝酵母菌心内膜炎患者既往风心病病史40余年,1年前行二尖瓣置换手术。患者多次发热,并出现器官栓塞表现,多次血培养回报为“近平滑假丝酵母菌”。胸部CT及超声心动图均可明确二尖瓣术后改变,且疑似可见二尖瓣区赘生物形成,(1-3)-β-D葡聚糖>600.0 pg/mL,胸腔积液。根据Duke标准诊断为感染性心内膜炎。应用氟康唑治疗无效,反复应用卡泊芬净抗感染治疗后体温可平稳,但停药后反复发作,建议患者再次行瓣膜手术治疗。结论人工瓣膜置换术后近平滑假丝酵母菌心内膜炎临床少见,有血流感染及多器官栓塞的临床表现。抗真菌药物联合手术治疗可有效改善患者预后。

1株近平滑假丝酵母的分离及其鉴定

采用平板稀释法从土壤及水果中分离出1株近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）,YPD培养基培养酵母,利用分子生物学方法对其rRNA基因内转录间区（ITS区）进行了克隆测序,并与GenBank中已有的有关序列进行比较及系统发育分析。测序结果表明该序列长度为547 bp,与GenBank中近平滑假丝酵母同源率在98.5%~100%之间,进化分析表明与C.parapsilosis（EF193067）、C.parapsilosis UOA/HCPF（FJ872013）属于一单独分支中,形态结果及分子鉴定表明近平滑假丝酵母培养成功,为其进一步开发利用提供了依据。

四味黄连洗剂对白色念珠菌和近平滑假丝酵母菌抑菌作用研究及有效成分筛选

目的:讨论四味黄连洗剂提取物体外对真菌的抑菌作用;明确四味黄连洗剂的主要抑菌药材和成分。方法:以K-B法药敏实验体外测定四味黄连洗剂对白色念珠菌、近平滑假丝酵母菌代谢活性的影响,探讨四味黄连洗剂有效药味并进行缺味验证实验;CLSI法测定四味黄连洗剂的最低MIC值;CLSI和Spot assay法测定盐酸小檗碱的最低MIC值及对近平滑假丝酵母菌细胞活性的影响。结果:四味黄连洗剂对近平滑假丝酵母菌有明显抑制;对近平滑假丝酵母菌最低抑菌浓度为128μg/mL;黄连、黄柏为有效抑菌药材;有效成分盐酸小檗碱对近平滑假丝酵母菌的MIC值为64μg/mL,对近平滑假丝酵母菌细胞活性有较大影响。结论:该研究表明,四味黄连洗剂对近平滑假丝酵母菌有抑制作用,且其主要有效抑菌成分为盐酸小檗碱。

近平滑假丝酵母(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的外泌表达及高效转化(R)-苯基乙二醇

克隆了近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(R)-羰基还原酶基因rcr,构建胞外表达工程茵Escherichia coli BL21(DE3)/pET20b-rcr,实现了(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中高效外泌表达,周质空间和发酵液酶的比活力分别达0.68 U/mg和0.26 U/mg,与大肠杆菌的胞内体系重组酶相比,酶的比活力提高了近两倍。为了更好地促进该重组酶的外分泌于大肠杆菌细胞外,通过添加温和型化学渗透剂甘氨酸,改善细胞壁的透性,(R)-羰基还原酶的活力提高至1.99 U,与添加甘氨酸前相比,酶活力提高了12.4倍,比活提高了4.3倍。浓缩后的发酵液催化2-羟基苯乙酮,产生(R)-苯基乙二醇,产率为88.1%,e.e.值为93.9%。与胞内重组酶相比,产率和光学纯度分别提高了44.4%和15.9%。本研究通过构建(R)-羰基还原酶的大肠杆菌分泌表达体系,大幅度提高了(R)-羰基还原酶的比活和生物转化手性醇的效率。

近平滑假丝酵母催化立体异构反应中试放大研究

近平滑假丝酵母催化立体异构反应制备光学纯手性芳基醇立体选择性和转化效率高,具有良好工业化放大价值。本研究以Candida parapsilosis CCTCC M203011催化外消旋苯基乙二醇立体异构反应制备(S)-苯基乙二醇为对象考察中试规模下生物催化剂制备和生物转化反应过程。研究发现,按照等通风量和等搅拌桨末端速度为基准进行生物催化剂制备规模放大后,菌体浓度提高至65 g/L,但发酵终了pH下降为2.7,异常产酸,并丧失催化特性。在发酵产酸分析基础上,运用发酵培养基组成、恒pH发酵、发酵溶氧控制等策略,在最优条件下,实现了150 L罐催化剂的高效制备,并成功实现50 L反应釜的转化放大,产物(S)-苯基乙二醇e.e.>99.4%,产率>95.2%。

近平滑假丝酵母发酵产甘露醇

从甘蔗汁中筛选出1株利用葡萄糖产甘露醇的菌株,经鉴定为近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)。研究其发酵生产甘露醇的条件,通过单因素实验和正交实验优化后,培养基配方为:200 g/L葡萄糖,30 g/L酵母膏,0.05 g/L CaCl2·2H2O,0.02 g/L FeCl3·2H2O,0.5 g/L MgSO4·7H2O,此条件下摇瓶培养甘露醇产量为61.7 g/L。进行30 L发酵罐扩大培养,根据发酵曲线得知72 h时甘露醇最大产量为80.3 g/L。

醇类物质诱导培养改善近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)去消旋转化能力

采用近平滑假丝酵母Candidaparapsilosis全细胞去消旋转化外消旋苯基乙二醇(PED)制备S-苯基乙二醇.主要研究了在菌体培养阶段添加底物醇类和酮类对菌体生长及菌体产酶的影响.研究发现添加乙醇可以促进细胞生长,提高细胞中脱氢酶活力,从而改善菌体立体选择性转化能力.通过在菌体培养至对数生长期时添加0.1%乙醇,菌体量增长10%,相对酶活提高30%,采用相同浓度菌体转化105mmol/L(R,S)-苯基乙二醇时,产物(S)-苯基乙二醇的对映过量值从90%提高至99%,产率从87.3%提高至92.4%.

红树林近平滑假丝酵母菌胞外多糖在外阴阴道假丝酵母菌病模型小鼠中的效果评估

目的了解红树林近平滑假丝酵母菌(C.parapsilokis)的胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)更多的生物学作用。方法构建BALB/c小鼠外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)模型,60只雌性BALB/c小鼠(8～10周龄,24～28 g)随机均分为雌激素诱导的VVC组(V组,n=20)、胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)干预和雌激素诱导的VVC组(E组,n=20)、仅进行雌激素化的阴性对照组(C组,n=20)和空白对照组(B组,n=20)。V组、E组和C组小鼠在接种前6 d开始皮下注射含有0.1 mg苯甲酸雌二醇的油剂0.1 mL,1次/2 d。B组皮下注射同等体积的无菌橄榄油。给药1周后,E组和V组接种白假丝酵母菌(ATCC 10231)孢子5×10^(7 ), B和C组接种等体积的PBS。接种后第4、7、14天每天随机抽选各组小鼠5只,收集各组小鼠阴道灌洗液进行菌落计数。收集小鼠的阴道局部组织进行石蜡切片HE染色和芯片检测。结果 E组和V组小鼠于接种白假丝酵母菌3～5 d后出现外阴红肿,阴道灌洗液可见豆渣样分泌物。C组和B组小鼠未见明显异常改变。小鼠阴道局部白假丝酵母菌载量并未因EPS的干预发生明显改变,但是阴道局部组织石蜡切片观察发现,中性粒细胞计数(PMN)的浸润程度明显减轻,S100A8、S100A9等表达水平下调。结论 EPS的应用可在VVC模型中具有较好的抗炎效应,这一作用与EPS对S100A8/A9的剂量依赖阻碍表达相关。

老年ICU患者近平滑假丝酵母菌血行感染分析

目的 观察老年重症加强治疗病房(GICU)患者近平滑假丝酵母菌血行感染的临床特征和应用抗真菌药物治疗的效果及安全性.方法 回顾性分析2012年11月至2015年6月收住天津医科大学总医院GICU血培养或导管培养真菌阳性60例患者的临床资料,其中近平滑假丝酵母菌感染45例(近平滑菌感染组),非近平滑假丝酵母菌感染15例(非近平滑菌感染组).收集两组患者性别、年龄、急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分、序贯器官衰竭评分(SOFA)、抗菌药物应用时间和机械通气、基础疾病、导管相关感染、置管方式患者例数以及肌酐(Cr)、血红蛋白(Hb)、血小板计数(PLT)、白蛋白(ALB)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平等临床资料,比较两组患者上述指标的差异;采用多因素Cox回归分析影响患者预后的危险因素;统计两组患者7、14和28 d生存率,观察不同抗真菌药物治疗后对患者生存率的影响和对肝功能的损害情况.结果 非近平滑菌感染组患者机械通气所占比例明显高于近平滑菌感染组〔73.3% (11/15)比33.3%(15/45),P<0.05〕,其余各项临床特征比较差异均无统计学意义(均P>0.05).近平滑菌感染组和非近平滑菌感染组患者7、14和28 d生存率比较差异均无统计学意义〔7 d:82.2%(37/45)比66.7% (10/15),14 d:75.6%(34/45)比60.0%(9/15),28 d:66.7%(30/45)比46.7%(7/15),均P>0.05〕.近平滑假丝酵母菌感染患者应用棘白菌素类和唑类药物治疗7、14和28 d生存率比较差异亦无统计学意义〔7 d:100.0% (23/23)比82.4%(14/17),14 d:91.3%(21/23)比76.5%(13/17),28 d:78.3%(18/23)比70.6%(12/17),均P>0.05〕.Cox回归分析显示:糖尿病〔优势比(OR)值=0.268,95%可信区间(95%CI)=0.077~0.928,P=0.038〕、近平滑假丝酵母菌感染(OR值=0.260,95%CI=0.072~0.946,P=0.041)、APACHEⅡ(OR值=1.241,95%CI=1.051~1.466,P=0.011)和SOFA评分(OR值=1.405,95%CI=1.005~1.966,P=0.047)均是影响患者预后的危险因素.应用棘白菌素类和唑类抗真菌药物治疗患者肝损害加重和新发肝脏损伤比例比较差异均无统计学意义(肝损害加重:18.8%比21.0%,新发肝脏损伤:6.2%比10.5%,均P>0.05).结论 GICU患者真菌血症以近平滑假丝酵母菌感染为主,糖尿病、近平滑假丝酵母菌感染、APACHEⅡ和SOFA评分均是影响患者预后的危险因素.

氟康唑和伏立康唑治疗新生儿近平滑假丝酵母菌败血症的临床分析

目的探讨氟康唑和伏立康唑治疗新生儿近平滑假丝酵母菌败血症的临床效果,为该类患儿临床抗真菌药物的选择提供参考。方法回顾性分析2014—2018年收治新生儿近平滑假丝酵母菌败血症55例的临床资料,根据首选治疗药物分为首选氟康唑组(31例)和首选伏立康唑组(24例)。比较两种药物初始治疗显效比例、以及并发中枢感染在内的治愈患儿整体疗程和病死率。结果首选氟康唑组:治愈28例,疗程为(31.39±12.40)d;其中15例治疗(6.67±2.19)d后血培养转阴,疗程(23.13±2.72)d;其余13例治疗至14 d血培养仍持续阳性,换为伏立康唑治疗(需挽救治疗)(6.31±2.21)d后血培养转阴,(25.38±10.20)d后痊愈,疗程(氟康唑+伏立康唑治疗疗程)为(40.15±11.31)d。死亡1例,放弃2例,病死率9.68%。首选伏立康唑组:24例均治愈无死亡病例;治疗(7.83±2.41)d后血培养转阴(2周内转阴为治疗初始显效),治疗初始显效比例高于首选氟康唑组(χ^(2)=6.469,P<0.01);疗程为(25.83±5.55)d,短于首选氟康唑组治愈患者疗程(t=2.136,P<0.05)。两组治愈患者中均未发现药物相关副作用。结论首选伏立康唑可能较氟康唑更适合新生儿近平滑假丝酵母菌败血症的治疗,但其有效性和安全性仍需进一步明确。