PGC-1α对线粒体氧化应激反应及人肾皮质近曲小管上皮细胞焦亡的影响

目的探讨PGC-1α对线粒体氧化应激反应及人肾皮质近曲小管上皮(HK-2)细胞焦亡的影响。方法将HK-2分为对照组(Con组。21%氧气)和缺氧/复氧组(Hyp-R组。用1%氧气培养12 h后立刻用21%氧气培养12 h)、缺氧/复氧组加溶剂对照组(Hyp-R+S组。用1%氧气培养12 h,加入DMSO溶液后立刻用21%氧气培养12 h)、缺氧/复氧组加药物干预组(Hyp-R+ZLN组。用1%氧气培养12 h,加入PGC-1α激动剂ZLN005后立刻用21%氧气培养12 h)。检测各组细胞凋亡率、活性氧含量、线粒体膜电位水平和细胞上清液中IL-10、IL-18的含量,以及细胞焦亡相关蛋白表达水平和线粒体动力学相关蛋白表达水平。观察各组细胞及线粒体形态结构。结果1.Hyp-R组与Con组相比,Caspase-1、Nlrp3、GSDMD-N、Drp1蛋白表达增多(P<0.05),细胞上清液中IL-18的分泌增多(P<0.05),细胞晚期凋亡率升高(P<0.05),活性氧含量增多(P<0.05),JC-1单聚体荧光含量增多(P<0.05)。2.Hyp-R+ZLN组与Hyp-R组相比,细胞焦亡相关蛋白表达减少,细胞上清液中IL-18的分泌减少(P<0.05),活性氧含量减少(P<0.05),JC-1单聚体荧光含量减少(P<0.05)。3.Hyp-R组的线粒体肿胀、线粒体嵴溶解,细胞具有部分疑似焦亡的特征;Hyp-R+ZLN组被破坏的细胞及线粒体结构得以修复。结论PGC-1α通过调控线粒体生物合成改善线粒体功能、影响HK-2细胞焦亡。

葡萄糖诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞凋亡信号传导途径的研究

目的:探讨葡萄糖诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)凋亡的信号传导途径。方法:利用葡萄糖诱导细胞凋亡:将不同浓度葡萄糖作用于HK-2细胞不同时间,并经透射电镜观察、流式细胞仪(FCM)检测凋亡细胞。采用抑制剂拮抗葡萄糖诱导凋亡:分别将不同浓度的蛋白激酶C抑制剂(hypericin)、半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)抑制剂(apopain)、蛋白酪氨酸激酶抑制剂(genistein)、一氧化氮合酶抑制剂(NAME)作用于HK-2细胞30min,再加50mmol/L葡萄糖作用48h,后行FCM检测HK-2细胞凋亡情况。结果:50mmol/L葡萄糖作用48h可诱导HK-2细胞发生凋亡,并可通过透射电镜观察到凋亡小体,而FCM检测发现10-4mmol/Lhypericin、10-4mmol/L和10-6mmol/Lapopain、10-7mmol/Lgenistein、10-2mmol/LNAME可明显抑制葡萄糖诱导的HK-2细胞凋亡。结论:蛋白激酶C、caspase-3、蛋白酪氨酸激酶、一氧化氮(NO)都参与了葡萄糖诱导HK-2细胞凋亡的信号传导过程。

葡萄糖诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞内钙离子浓度动态变化及其信号传导途径的研究

目的:探讨葡萄糖诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)内钙离子(Ca2+)浓度的动态变化及其信号转导途径。方法:在葡萄糖诱导的HK-2细胞中加入不同浓度的蛋白激酶C抑制剂(Hypericin)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Apopain)、蛋白酪氨酸激酶抑制剂(Genistein)、一氧化氮合酶抑制剂(NAME),利用激光共聚焦显微镜(LSCM)观察HK-2细胞内[Ca2+]动态变化。结果:LSCM下观察发现,150mmol/L葡萄糖可引起HK-2细胞内[Ca2+]增高。150mmol/L葡萄糖诱导的HK-2细胞中加入10-4mmol/LHypericin、10-6mmol/LApopain、10-7mmol/LGenistein、10-2mmol/LNAME可抑制葡葡萄糖诱导的HK-2细胞内[Ca2+]增高。结论:葡萄糖作用于HK-2细胞,可引起细胞内[Ca2+]增高;蛋白激酶C、caspase-3、蛋白酪氨酸激酶、一氧化氮(NO)均参与了葡葡萄糖诱导的HK-2细胞内[Ca2+]增高的信号传导过程。

丹参酮ⅡA对脂多糖诱导人肾皮质近曲小管损伤的影响研究

目的:探究丹参酮ⅡA对人肾皮质近曲小管细胞活力及炎症的影响。方法:通过脂多糖诱导建立人肾皮质近曲小管细胞系(HK-2)炎症损伤模型,并给予丹参酮ⅡA干预;通过形态学观察、CCK8实验评估丹参酮ⅡA对HK-2细胞活力的影响,通过实时荧光定量PCR实验检测细胞炎症因子TNF-α及IL-1β的表达水平,以评价丹参酮ⅡA对HK-2炎症的影响。结果:给予脂多糖干预会导致HK-2出现异常增殖及形态异常,在4μg/mL浓度时其细胞增殖率达到最高。10、20、40、80μM的丹参酮ⅡA会导致HK-2的增殖率显著下降,并在一定程度上改善其细胞形态。20、40、80μM的丹参酮ⅡA可抑制脂多糖诱导的细胞异常增殖及炎症因子TNF-α和IL-1β的表达。结论:丹参酮ⅡA能改善人肾皮质近曲小管的异常增殖及炎症损伤。

近侧皮质椭圆式扩孔对改善下肢长骨骨折锁定钢板固定后不对称愈合的影响

近侧皮质椭圆式扩孔技术是由美国华盛顿大学的Gardner等^([1])提出的一种改良的锁定螺钉固定方法,该技术是将钢板近侧皮质的锁定螺钉钉道扩成纵向的椭圆形,而远侧皮质则使用标准程序扩孔,这样可以降低锁定装置的轴向刚度,并在断端两侧可以产生对称的微动。研究证实,降低锁定钢板的刚度并促进钢板近远侧骨折块的对称性移动能促进骨折的Ⅱ期愈合^([2])。本研究采用近侧皮质椭圆式扩孔技术治疗下肢长骨骨折患者36例评价其疗效,现报道如下。

瘤段灭活再植治疗股骨皮质旁骨肉瘤1例(并文献复习)

皮质旁骨肉瘤占全身恶性骨肿瘤的0．6％～1％，临床少见，长管状骨好发。其治疗方式以手术为主，保肢治疗是医患双方的共同目标，符合现代肿瘤治疗发展趋势，主要方式有：肿瘤部分切除原位灭活、瘤段截除灭活再植、瘤段截除后异体半关节移植、肿瘤型人工关节置换。我科2010年5月采用瘤段截除体外灭活再植治疗股骨皮质旁骨肉瘤1例，取得了良好效果，现报告如下。

人重组骨形态发生蛋白7通过下调半胱氨酸蛋白酶-1/焦孔素D信号通路抑制高糖诱导的近曲小管上皮细胞的焦亡

目的 观察人重组骨形态发生蛋白-7(recombinant human bone morphogenetic protein-7,rhBMP-7)对高糖诱导的人肾皮质近曲小管上皮细胞(human kidney-2,HK-2)的焦亡和炎症反应的作用。方法 体外培养高糖(high glucose,HG)刺激的HK-2细胞模拟糖尿病肾病模型。分为正常浓度葡萄糖对照组(Control)、高浓度葡萄糖组(HG)、Control+rhBMP-7组、HG+rhBMP-7组。采用免疫荧光方法检测HK-2细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SAM)、焦孔素D(gasderminD, GSDMD)蛋白和焦孔素E(gasderminE, GSDME)蛋白;TUNEL染色检测细胞死亡情况;蛋白质印迹法检测各组HK-2细胞中焦亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、半胱氨酸蛋白酶-4(caspase-4)、半胱氨酸蛋白酶-5(caspase-5)、 N-GSDMD和GAPDH的表达;酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组HK-2细胞培养上清液中炎症因子白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达。结果 与Control组相比,高糖组HK-2细胞Tunel染色的阳性率明显增加,差异具有统计学意义(P<0.000 1),α-SMA蛋白和α-SMA mRNA表达量也显著增加(P<0.000 1),E-cadherin蛋白和Ecadherin mRNA表达量显著下降(P=0.000 6,P<0.000 1);HG组添加rhBMP-7后α-SMA蛋白和m RNA水平显著下降(P=0.011 7, P=0.002), E-cadherin蛋白和m RNA水平明显升高(P=0.001 5,P<0.000 1)。与对照组比较,HG组HK-2细胞GSDME/GSDMD蛋白的荧光信号明显增强。进而,HG组添加rhBMP-7后GSDME/GSDMD蛋白荧光信号显著减弱。同样,HG组HK-2细胞中焦亡相关蛋白caspase-1、caspase-4、caspase-5以及GSDMD的表达量显著高于对照组,差异明显(均P<0.001)。HG组添加rhBMP-7后焦亡相关蛋白的表达明显下降(分别P<0.001,P=0.002,P<0.001)。与对照组比较,HG组HK-2细胞培养上清液中IL-1β和IL-18蛋白浓度显著增加(均P<0.001)。进而导致rhBMP-7干预后HG组细胞上清液中IL-10和IL-1β蛋白浓度明显减少(P<0.001)。结论 rhBMP-7具有抑制HK-2细胞焦亡的作用,其通过调控caspase-1/GSDMD信号通路减缓高糖诱导的HK-2细胞焦亡。

基于转录组学探讨水蛭素对HK-2细胞的影响机制

目的采用转录组学技术探讨水蛭素对人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)的影响及机制。方法利用CCK-8法检测水蛭素处理之后的HK-2细胞活力,通过转录组学的技术对溶媒对照组和水蛭素组进行转录组测序;通过RSEM的方法计算不同样品中的基因表达水平,差异基因的筛选采用DEseq2方法,筛选标准为|log2FC值|≥1,P<0.05。随后根据差异表达的基因进行富集分析。结果水蛭素5 mg/mL下提高HK-2细胞活力效果最佳,转录组学研究结果表明,与正常HK-2细胞相比,水蛭素处理后的HK-2细胞有1723个基因发生差异表达。GO和KEGG分析结果表明,炎症通路的调控是水蛭素治疗高尿酸血症的主要作用机制。结论水蛭素作用于多条炎症信号通路,进而促进尿酸排泄,促进集体代谢和尿酸排出体外,起到降尿酸的作用,表明水蛭素在治疗高尿酸血症方面效果显著。

骨旁骨肉瘤的影像学特点

目的:总结、分析骨旁骨肉瘤临床与影像学的特点。方法:分析研究51例骨旁骨肉瘤,51例中1例发生在髂骨,发生在股骨近端4例,股骨远端30例,胫骨近端7例,胫骨远端1例,肱骨近端7例,肱骨远端1例。结果:发生在股骨远端及胫骨近端的37例病例中X线表现为皮质骨增厚,软组织内可见团状和菜花状不规则高密度瘤骨。其中8例与骨皮质关系密切病例可见到骨皮质与肿瘤骨之间有一透亮带。发生在肱骨近端和股骨近端的11例均表现为密度增高的多发团状的瘤骨。结论:骨旁骨肉瘤的影像学综合检查分析对临床诊断和手术有着重要的指导作用。

骨旁骨肉瘤的临床影像学分析

目的分析骨旁骨肉瘤的临床影像学特点方法收集手术病理检查证实的骨旁骨肉瘤13例，回顾性分析其发病部位、肿块形态学特征、与骨皮质关系的影像学特点结果13例中发生在股骨9例，其中7例发生于股骨远端，股骨中段和近段各1例，肱骨近端、胫骨近端、尺骨中段、顶骨各1例.主要表现为软组织内不规则高密度瘤骨，其中4例与骨皮质间有透亮线结论骨旁骨肉瘤有一定的临床影像学特点，好发部位、不规则瘤骨等有助于做出准确诊断。

姜黄素亚型B14对HKⅡ细胞损伤的保护作用及机制

采用CCK-8比色法检测了姜黄素(Cur)及其亚型对人肾皮质近曲小管上皮细胞(HKⅡ)的损伤作用;采用ELISA法检测了不同浓度和时间条件下血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)对HKⅡ细胞Cleaved caspase-3表达的影响,并建立了糖尿病肾病细胞模型;利用此模型研究了B14对HKⅡ细胞的保护作用及机制.结果表明:Cur及其亚型B13,B14对HKⅡ细胞均无毒害作用;以AngⅡ250nmol/L培养48h时,可建立最佳糖尿病肾病模型.B14对AngⅡ引起的HKⅡ细胞损伤具有保护作用,且此种保护作用与PI3K信号通路有关.

股骨近端异体皮质骨板组织学及生物力学的实验研究

目的 探讨深低温冷冻异体皮质骨板在兔体内的组织学及生物力学性质变化 ,为临床应用异体皮质骨板提供理论依据。 方法 将深低温冷冻异体皮质骨板植入兔股骨干外侧 ,于植入后 2、4、8、16、2 4周取材 ,对其在体内的生物学替代过程从影像学、组织学、生物力学方面进行分析。结果 X线可见异体皮质骨板在植入体内 8周与宿主骨愈合。组织学可见异体骨板内表面早期即有毛细血管长入 ,有破骨细胞骨吸收 ,之后有新骨生成 ,术后 8周异体骨 5 %被新生骨替代 ,术后 16周异体骨 12 %被新生骨替代 ,术后 2 4周异体骨 2 1%被新生骨替代 ,外表面骨吸收及新骨生成不明显。在植入 4～ 8周可见骨痂包绕异体骨 ,与宿主骨已开始有骨愈合 ,植入 16周后可见宿主骨与异体骨间有骨生成。异体骨强度在植入早期下降较快 ,植入 16周时 ,异体骨强度为原强度 38% ,之后强度下降速度较慢 ,到 2 4周时为原强度 36 %。 结论 异体皮质骨板主要靠宿主骨痂包绕其边缘而愈合 ,异体骨板与宿主骨相接触内侧被替代且有新骨生成。

大黄不同炮制品和煎煮时间对TGF-β1诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞中E-cadherin和α-SMA浓度的影响

目的探讨不同大黄炮制品干预人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)的作用差异及筛选最佳的煎煮时间点。方法取生大黄、熟大黄、酒大黄、大黄炭饮片各350 g,均分为7份。每份药物分别煎煮5、7、9、10、15、20、30 min,最终制备浓度约1000 g/L药液。将145只大鼠随机分为生大黄组、熟大黄组、酒大黄组、大黄炭组,各组又分为5、7、9、10、15、20、30 min时间点的亚组,每个亚组5只,另设对照组5只。将各药物组大鼠分别给予相应的大黄煎剂以1.35 g/(kg·d)的剂量灌胃,对照组大鼠给予0.9%氯化钠2 ml灌胃,每日2次,第6日灌胃后制备含药血清。用大黄不同炮制品不同煎煮时间的含药血清干预经转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的HK-2细胞24 h,检测各组HK-2细胞中上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的浓度。结果α-SMA浓度最低的分别为生大黄10 min亚组(52.086 ng/ml)、熟大黄10 min亚组(44.596 ng/ml)、酒大黄9 min亚组(49.768 ng/ml)、大黄炭9 min亚组(58.470 ng/ml)。E-cadherin浓度最高的分别为生大黄10 min亚组(1.017 ng/ml)、熟大黄10 min亚组(1.325 ng/ml)、酒大黄9 min亚组(1.163 ng/ml)、大黄炭9 min亚组(0.787 ng/ml)。与大黄炭组比较,其余3组α-SMA浓度降低,E-cadherin浓度升高(P<0.05或P<0.01)。与熟大黄组比较,生大黄组和酒大黄组α-SMA浓度升高,E-cadherin浓度降低(P<0.05或P<0.01)。酒大黄组与生大黄组比较,α-SMA和E-cadherin浓度差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论大黄的四种炮制品均能有效抑制经TGF-β1诱导的HK-2细胞上皮间充质转化,其作用效果由强到弱依次均为熟大黄、酒大黄、生大黄、大黄炭,生大黄和熟大黄最佳煎煮时间为10 min,酒大黄和大黄炭最佳煎煮时间为9 min。

恩格列净改善高糖诱导HK-2细胞凋亡的机制探讨

目的探讨恩格列净改善人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)凋亡的机制。方法将HK-2细胞置于正常葡萄糖、高葡萄糖、高葡萄糖+不同浓度的恩格列净共干预环境下培养48 h。采用蛋白免疫印迹法检测肾脏沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)、硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)以及裂解的半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3)的表达水平。采用TUNEL染色评估HK-2细胞凋亡情况。结果蛋白免疫印迹结果显示,高葡萄糖培养48 h后HK-2细胞的TXNIP和cleaved Caspase-3表达水平均高于正常葡萄糖组,而SIRT1表达水平低于正常葡萄糖组(P均<0.05)。1000 nmol/L恩格列净和30 mmol/L葡萄糖共干预48 h后,HK-2细胞的TXNIP和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平降低,SIRT1表达水平升高(P均<0.001)。TUNEL染色结果显示恩格列净和30 mmol/L葡萄糖共干预组较30 mmol/L葡萄糖组TUNEL阳性细胞数少,且1000 nmol/L恩格列净和30 mmol/L葡萄糖共干预组凋亡改善更明显。结论恩格列净可能通过上调SIRT1的表达、抑制TXNIP表达,改善高糖诱导HK-2细胞凋亡。

高糖高脂及肝素结合蛋白对HK-2/中性粒细胞共培养体系的炎症作用

目的以人肾皮质近曲小管上皮(human kidney-2 cells,HK-2)细胞/中性粒细胞共培养体系为研究对象,探讨高糖高脂及肝素结合蛋白(heparin-binding protein,HBP)处理对共培养体系的炎症反应、氧化应激及细胞凋亡的影响。方法从正常人外周血中分离获得中性粒细胞,HK-2细胞与中性粒细胞悬液均以1×10^(5)/mL的浓度混匀建立共培养细胞体系。通过CCK-8试验确定脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和肝素钠(heparin sodium,Hep)的处理浓度,分别通过免疫荧光干式定量法、邻苯三酚自氧化法、基于细胞测量珠阵列技术及检测表达Annexin V-FITC荧光的流式细胞术分别检测HBP浓度、氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量、炎性细胞因子[白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL6和IL-8]浓度及细胞凋亡百分率。结果CCK-8试验确定LPS和Hep的处理浓度分别为10μg/mL和50μmol/L;高糖高脂处理的HBP(4.11±0.07)、SOD(2.67±0.06)、IL-1β(11.28±0.35)、IL-6(2.57±0.10)、IL-8(1.32±0.05)及细胞凋亡发生率(1.08±0.04)相对值均较正常对照组明显增加;LPS处理(刺激HBP的产生)可使HBP(7.09±0.08)、SOD(3.07±0.14)、IL1β(22.96±0.49)、IL-6(2.79±0.11)、IL-8(1.55±0.07)及细胞凋亡发生率(1.17±0.05)相对值升高;通过Hep处理(降低HBP的产生)可使由LPS引起的HBP(5.43±0.09)、SOD(2.76±0.07)、IL-1β(16.51±0.56)、IL-6(2.64±0.16)、IL-8(1.47±0.06)及细胞凋亡发生率(1.13±0.05)相对值降低。结论高糖高脂状态及HBP均可影响肾小管上皮细胞的功能,其机制可能与促进氧化应激和炎症反应有关。

浅表性骨肉瘤临床病理分析及其微血管密度研究

目的分析浅表性骨肉瘤（OS）的临床、影像学及病理学特征,以CD105标记微血管密度（MVD）探讨与临床病理因素的关系,提高对浅表性OS诊断、鉴别诊断水平和生物学行为评估。方法回顾性分析2006年1月至2012年12月经手术病理证实的11例浅表性OS临床、影像学及病理资料,并进行随访;应用免疫组化SP法检测11例浅表性OS中CD105的表达及MVD,并与18例正常骨组织、29例普通OS对照,分析CD105在浅表性OS中的表达及CD105-MVD与临床病理因素的关系。结果 （1）11例浅表性OS中,骨旁OS 7例（1例双肺胸膜下转移）,骨膜OS 3例,高级别表面OS 1例;年龄16∽68岁,平均26岁;7例股骨远端后面,胫骨近端3例,肱骨远端1例。（2）影像学显示7例呈均一致密的骨性肿块,4例围绕骨表面生长,肿瘤与骨皮质间形成1∽2 mm透亮间隙;CT扫描7例示肿瘤呈高密度肿块,3例骨皮质不完整,肿块内可见低密度间隔,邻近骨皮质增厚,无骨质破坏,1例见骨膜反应,11例均无Codman三角,未侵犯骨髓腔;诊断准确率DR为81.8%（9/11）,CT为54.5%（6/11）,MRI为63.6%（7/11）,3种影像学检查方法结合准确率为90.9%（10/11）。（3）CD105、CD105标记的MVD在浅表性OS中的阳性表达（81.8%、32.51±11.02）明显高于正常对照组（38.9%、22.51±9.53）（P〈0.05）,与普通OS阳性表达率（82.76%）差异无统计学意义（P〉0.05）,但CD105标记的MVD差异有统计学意义（P〈0.05）,而CD105、CD105标记的MVD在浅表性OS及普通OS中的阳性表达与肿瘤大小、性别、年龄无关（P〉0.05）,在普通OS中与转移有关（P〈0.05）。（4）浅表性OS随访2∽7年,10例患者无瘤健在,1例存活74个月（高级别表面OS,49个月后复发为去分化OS）。结论浅表性OS诊断依靠临床、影像学及病理多学科结合,采用传统X线、DR和CT联合检查可提高诊断准确率;浅表性OS中CD105-MVD明显增高,肿瘤性血管生成,参与浅表性OS的发生、发展及影响预后,CD105及CD105-MVD可作为判断生物学行为的参考指标。