近端肾小管上皮细胞代谢重编程在急性肾损伤中的研究进展

肾脏是一个高代谢器官,尤其是近端肾小管上皮细胞,在生理情况下主要依赖脂肪酸氧化供能,但是在急性肾损伤(AKI)期间,线粒体和过氧化物酶体功能障碍,近端肾小管上皮细胞发生代谢重编程,能量供应转向糖酵解,生成乳酸,并伴脂肪酸氧化紊乱及糖异生受损,短期内代谢重编程可能是对肾脏有益的能量代偿,但是该过程中也会加重肾损伤。本文就近端肾小管上皮细胞代谢重编程在AKI中的作用进行综述。

益肾软坚散含药血清拮抗马兜铃酸对人近端肾小管上皮细胞的作用

目的:研究益肾软坚散含药血清能否拮抗马兜铃酸(aristolochicacid,AA)诱发的人近端肾小管上皮细胞株(HKC)促纤维化效应。方法:用马兜铃酸钠盐(AA Na,40mg·L-1)加或不加10%大鼠含药血清与HKC细胞孵育,而后检测信使RNA(mRNA)和蛋白质表达。结果:大鼠含药血清能显著下调AA Na刺激后HKC细胞对转化生长因子β1(TGFβ1)、结缔组织生长因子(CTGF)和金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP1)mRNA及蛋白质的高表达(P<0.05),但对纤溶酶原激活物抑制物1(PAI1)mRNA及蛋白质高表达无显著作用(P>0.05)。结论:益肾软坚散含药血清可下调AA刺激的HKC细胞促细胞外基质(ECM)合成因子及抗ECM降解因子的表达。

转化生长因子-β刺激人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子的表达

目的:探讨转化生长因子-β(TGF-β)对人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法:应用逆转录-聚合酶链反应(RTP-CR)和蛋白印迹技术,观察TGF-β1对人近端肾小管上皮细胞(HK-2)α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CTGFmRNA及其蛋白质表达的影响,同时观察肾小管上皮细胞形态改变。结果:HK2细胞有基础量的CTGFmRNA和蛋白质分子表达,在TGF-β1刺激下,其表达量显著增加,经不同浓度TGF-β1干预24h后,CTGFmRNA表达量明显升高,且呈剂量依赖性。1ng/mlTGF-β1刺激时,CTGFmRNA表达量开始显著增加,5ng/ml时达到高峰,10ng/ml时略有下降,CTGFmRNA表达量分别为对照组的2.40倍,3.34倍和2.73倍(P<0.05)。CTGFmRNA表达量呈时间依赖效应。TGF-β1(5ng/ml)干预30min后,CTGFmRNA表达量开始呈现增加趋势,为对照组的1.48倍(P>0.05),2h后出现显著差异,为对照组的2.14倍(P<0.05);CTGFmRNA表达量在24h达到高峰,持续至36h,分别为对照组的3.19倍和2.75倍(P<0.005);0.5ng/mlTGF-β1刺激时,CTGF蛋白表达量略有增加,5ng/ml时达到高峰,10ng/ml时略有下降。在TGF-β1(5ng/ml)干预下,HK2细胞由立方形铺路石样逐渐转变为长梭形长条样,免疫荧光检测见梭形细胞胞浆中有大量αSMA表达。大部分细胞转分化的时间(72h)明显晚于CTGFmRNA?

人近端肾小管上皮细胞的原代培养

目的应用组织块培养法建立人近端肾小管上皮细胞的原代培养方法。方法取肾皮质组织块,应用无血清培养液进行原代培养,融合后用胰蛋白酶-EDTA消化传代。取第三代细胞检测细胞角蛋白、波形蛋白、碱性磷酸酶、结蛋白、Ⅷ因子、α-肌动蛋白的表达,应用扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构。结果融合的上皮单层细胞呈铺路石样表现,伴圆顶(dome)形成。细胞角蛋白、波形蛋白和碱性磷酸酶染色阳性,α-肌动蛋白、Ⅷ因子相关抗原、纤维连接蛋白和结蛋白染色阴性。细胞存在极性,细胞尖端存在短的微绒毛,细胞之间连接紧密。结论应用组织块培养法结合无血清培养液可以成功建立原代人近端肾小管上皮细胞系。

大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定

目的建立较好的大鼠近端肾小管上皮细胞原代培养模型。方法无菌取Wistar大鼠肾脏,取皮质剪碎,经Ⅰ型胶原酶消化和45%Percoll连续密度梯度离心进行纯化,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基原代培养并传代,观察细胞形态并以免疫细胞化学染色及酶化学染色鉴定。结果培养4～5d细胞融合成单层,呈典型的鹅卵石样,细胞角蛋白18及碱性磷酸酶染色均呈阳性,细胞可传2～3代。结论此法可在短期获得数量较多、重复性好的近端肾小管上皮细胞,为体外研究肾小管细胞的病变提供了实验平台。

大黄酸对高糖和血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞肥大的影响

目的:探讨大黄酸(Rhein)对高糖和血管紧张素Ⅱ(angiotensin,AngⅡ)诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞肥大的影响。方法:麻醉下,无菌分离大鼠单根近球小管并培养,以免疫细胞化学方法鉴定体外培养的肾小管上皮细胞。在高糖(30 mmol/L)环境下用AngⅡ(10-7mol/L)刺激肾小管上皮细胞肥大。与此同时,加入不同浓度的大黄酸(30、15、5 mg/L),作用72 h后检测细胞体积、3H-亮氨酸掺入量以及蛋白质含量以观察细胞肥大的变化。结果:高糖(30 mmol/L)+AngⅡ(10-7mol/L)培养72 h导致细胞体积显著增大,3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量显著增加。加入大黄酸处理72 h后,大黄酸30 mg/L可显著降低高糖和AngⅡ所致的细胞体积增大、3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量的升高。大黄酸15 mg/L降低了3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量,而对细胞体积无显著抑制作用。大黄酸5 mg/L可降低细胞内蛋白质含量,而对细胞体积及3H-亮氨酸掺入量无显著抑制作用。结论:大黄酸能抑制高糖和AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞肥大。

糖化白蛋白诱导人近端肾小管上皮细胞产生损伤与炎性反应的表达

目的探讨在糖化白蛋白(glycated albumin,GA)刺激下,人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞系)中肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)及炎性反应相关细胞因子的表达情况。方法分别采用不同浓度的GA与白蛋白(albumin,Alb)刺激HK-2细胞12 h、24 h及48 h,通过real-time PCR和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunesorbent assay,ELISA)分别检测NGAL、KIM-1的mRNA表达与蛋白释放水平,并运用流式液相多重蛋白定量技术检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)和可溶性细胞间黏附分子-1(soluble intercellular cell adhesion molecule-1,sICAM-1)等细胞因子的浓度。结果与对照组与Alb组比较,GA刺激HK-2细胞12 h、24 h和48 h均能显著上调KIM-1和NGAL的mRNA表达(P<0.05)以及KIM-1和NGAL蛋白的释放(P<0.05);GA组sICAM-1、VEGF与IL-8水平在各时间点均高于Alb组和对照组(P<0.05)。结论 GA能上调KIM-1和NGAL mRNA的表达与蛋白的释放,并促进炎性细胞因子的分泌从而对肾小管造成损伤,提示GA可反映糖尿病肾脏受累情况。

高糖环境下近端肾小管上皮细胞c-fos/c-jun的表达

目的 :研究高糖作用下近端肾小管上皮细胞c fos、c jun的表达 ,探讨c Fos/c Jun异二聚体 (活化蛋白 1,AP 1)在介导高糖致近端肾小管细胞过度合成细胞外基质 (ECM)中的作用。 方法 :采用LLC PK1细胞株 ,将细胞分为正常对照组 (NG组 ,5 5mmol/LD 葡萄糖 )及高糖组 (HG组 ,2 5mmol/LD 葡萄糖 ) ;c fos、c junmRNA检测运用半定量RT PCR法 ,蛋白检测采用细胞免疫化学法。 结果 :HG组c fos、c junmRNA分别在 1、2h出现升高 ,并分别在 12、2 4h达最高峰 ;NG组上述基因的表达均无显著改变 ;与NG组相比 ,HG组c fos、c junmRNA分别升高1 63倍、1 67倍 ;HG组c Fos蛋白水平无明显变化 ,c Jun蛋白则显著升高达 4 5 %。 结论 :高糖能促进近端肾小管细胞c fos、c jun的表达 ,并可能通过AP 1(c Fos/c Jun)的形成增加介导高糖促进ECM表达的致病作用。

质粒表达型siRNA对人近端肾小管上皮细胞cubilin表达的抑制作用

目的观察cubilinsiRNA真核表达载体对人近端肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cell line,HKC)cubilin基因的特异性抑制作用。方法针对人cubilin基因设计并构建siRNA真核表达载体pSUPER EGFP-C1和pSUPER EGFP-C2,转染HKC,经荧光定量PCR(FQ-PCR)检测cubilin mRNA的表达、不同浓度的人血清白蛋白(HSA)刺激正常HKC及转染重组质粒的HKC24h后cubilin mRNA的表达,并通过激光共聚焦扫描荧光显微镜观察HKC对白蛋白摄取情况的变化。结果FQ-PCR显示HSA刺激正常HKC后cubilin mRNA表达具有剂量依赖性。与正常对照组相比,两个重组质粒均可部分抑制HKC cubilin表达,抑制效率分别为66%和37%,HSA刺激转染pSUPER EGFP-C1、pSU-PER EGFP-C2的HKC后cubiin mRNA水平较正常对照组比较分别下降50%、34%,转染了重组质粒的HKC对白蛋白的摄取明显减少。结论成功地构建了针对人cubilin基因的RNA干扰真核表达载体,表达型siRNA可抑制肾小管上皮细胞cubilin基因的表达及对白蛋白的摄取。

IFN-γ对培养的人近端肾小管上皮细胞表达PD-L1的影响

目的 了解培养的人近端肾小管上皮细胞株HK2细胞程序性死亡配体 (PD L1)的表达及其影响因素。方法 RT PCR、流式细胞计数和免疫细胞化学染色法。结果 正常的HK2细胞表达少量PD L1mRNA和蛋白,2 0 0ng mLIFN γ刺激2 4h后其表达升高,并持续至72h ;不同质量浓度的IFN γ(5 0、10 0、2 0 0ng mL)刺激HK2细胞2 4h后,PD L1表达呈剂量依赖性升高,与对照组比较差异显著(P <0 .0 1)。结论 IFN γ刺激培养的HK2细胞表达PD L1升高,推测HK2细胞上表达的PD L1有可能和T细胞上的受体PD 1结合,影响肾小管间质的发病。

血管紧张素Ⅱ对培养的人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子mRNA表达的影响

目的 :研究血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子mR NA表达的影响。方法 :采用体外培养人近端肾小管上皮细胞株 (HPTC) ,分别观察不同浓度(0、10 -9、10 -7、10 -5mol·L-1)AngⅡ处理 48h ,或用AngⅡ (浓度为 10 -7mol·L-1)处理不同时间 (0、12、2 4、48、72h)对HPTC结缔组织生长因子 (CTGF)mRNA表达的影响 ,CTGFmRNA表达采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法测定。结果 :AngⅡ (10 -7mol·L-1)作用于HPTC12h后 ,细胞CTGFmRNA的表达开始增加 ,72h达最高水平 ,与对照组相比 ,AngⅡ作用 48h后显著增加〔(0 0 97± 0 0 15 )vs(0 63 2± 0 0 41) ,P <0 0 1〕 ;无AngⅡ的DMEM培养HPTC ,72h内细胞CTGFmRNA水平未见明显改变 (P >0 0 5 )。不同浓度 (10 -9、10 -7、10 -5mol·L-1)AngⅡ作用于HPTC 48h ,CTGFmRNA的表达均有增加 ,分别是对照组 (0mol·L-1)的 1 5、5 5和 7 4倍 (P <0 0 1) ,对扩增产物进行测序证实与基因库中人CTGF的cDNA序列一致。结论 :AngⅡ呈时间和剂量依赖性地刺激HPTCCTGFmRNA表达 。

高糖诱导大鼠近端肾小管上皮细胞肥大

目的观察高糖培养对大鼠近端肾小管上皮细胞肥大的影响。方法SD大鼠,麻醉下,无菌分离单根近球小管并培养,以免疫细胞化学方法鉴定体外培养的肾小管上皮细胞。不同浓度糖(10mM,20mM,30mM)培养肾小管上皮细胞,72小时后检测细胞体积、3H-亮氨酸掺入量以及蛋白质含量,以观察细胞肥大情况。结果高糖(20mM,30mM)培养72小时,导致肾小管上皮细胞体积明显增大,3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量明显增加。结论高糖培养可诱导肾小管上皮细胞肥大。

硫化氢对顺铂诱导近端肾小管上皮细胞凋亡的干预研究

目的探讨硫化氢H_2S对顺铂(DDP)诱导近端肾小管上皮细胞凋亡的干预作用。方法研究分为阴性对照组、DDP组、DDP+硫氢化钠NaHS组。DDP组:DDP浓度为0、1、2、5、10、20和40 mg/L;DDP+NaHS组:NaHS浓度分别为0、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0和2.0 mmol/L,加DDP(20 mg/L)共同作用。噻唑蓝(MTT)实验:DDP组、DDP+NaHS组与人近端肾小管上皮细胞株(HK-2细胞)共同培养,24 h后测光密度(OD)值。NaH(0.5S和1.0 mmol/L)加DDP(20 mg/L)与HK-2细胞共同培养24 h。4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI),Annexin V-FITC/PI染色通过显微镜观察各组细胞的形态学改变。Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果 MTT实验:0、1、2、5、10和20 mg/L DDP浓度的OD值分别为(0.270±0.064)、(0.229±0.022)、(0.198±0.024)、(0.189±0.069)、(0.188±0.030)和(0.165±0.012),OD值随DDP浓度上升逐渐下降,在20 mg/L低于阴性对照组(P<0.05)。20 mg/L DDP加浓度分别为0.2、0.4、0.5、0.8和1.0 mmol/L NaHS的OD值分别为(0.173±0.051)、(0.186±0.023)、(0.259±0.050)、(0.263±0.033)和(0.268±0.098),以上与浓度为20 mg/L DDP的OD值(0.153±0.017)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。DAPI、Annexin VFITC/PI染色荧光显微镜显示,对照组HK-2细胞平均凋亡细胞数为(4.230±1.015),20 mg/L DDP影响下为(35.020±6.079),两者差异有统计学意义(P<0.05),DDP组高于阴性对照组。DDP+NaHS组在0.5和1.0 mmol/L的平均凋亡细胞分别为(22.550±2.912)和(9.780±2.063),差异有统计学意义(P<0.05),DDP+NaHS组低于DDP组。Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测,阴性对照组HK-2细胞凋亡率(5.167±0.612)%,在20 mg/L DDP影响下,为(31.598±1.014)%,细胞凋亡率增加(P<0.05)。合用NaHS凋亡减少,在0.5和1.0 mmol/L的凋亡率为(18.375±2.239)%和(11.636±1.233)%,差异有统计学意义(P<0.05),DDP+NaHS组低于DDP组。结论 NaHS对DDP导致的近端肾小管上皮细胞的凋亡有保护作用。

特异性shRNA抑制人近端肾小管上皮细胞Toll样受体4的表达

目的:研究RNA干扰法对人近端肾小管上皮细胞(HKC)中Toll样受体4(TLR4)表达的抑制作用。方法:将针对TLR4分子设计的采用体外转录生物合成的特异性短发卡RNA(shRNA)双链分子用脂质体转染的方法导入体外培养的HKC;应用免疫荧光染色在共聚焦显微镜下观察TLR4的分布及表达强弱;半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测TLR4及内参照-βactin在mRNA水平和蛋白水平的表达量。结果:干扰组TLR4的荧光强度显著低于对照组,其mRNA和蛋白的表达量分别下降了67%和62%。同时观察到TLR4主要分布于HKC细胞的胞膜及胞质区。结论:采用生物体外转录的方法成功合成针对TLR4的shRNA双链分子,并有效地转入HKC细胞中使TLR4的表达下调。

人近端肾小管上皮细胞诱导表达吲哚胺2,3-加双氧酶的实验研究

目的了解培养的人近端肾小管上皮HK2细胞株吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)的诱导表达情况及其影响因素。方法实验分为不同浓度(0、500、1000、2000U/ml)γ-干扰素(IFN-γ)刺激培养组和IFN-γ2000U/ml刺激12、24、48、72h不同时点培养组,以10%胎牛血清DMEM培养基作为正常对照组。RT-PCR检测不同培养条件下HK2细胞IDOmRNA的表达,免疫细胞化学染色检测24h后HK2细胞IDO的表达,高效液相色谱法检测培养基中犬尿氨酸、色氨酸浓度。结果正常HK2细胞不表达IDOmRNA和IDO蛋白。不同浓度IFN-γ刺激后,HK2细胞IDO mRNA的表达呈剂量依赖性升高,与正常对照组相比差异显著(P<0.05),同时IDOmRNA表达还呈时间依赖性地增高,以48h为最佳刺激时间。免疫组化染色显示,经IFN-γ刺激24h后,HK2细胞IDO蛋白表达增强,高效液相色谱检测显示刺激组培养基上清中犬尿氨酸特异性代谢率升高,表明表达的IDO具有生物活性,并且其活性呈IFN-γ剂量依赖性地升高。结论IFN-γ刺激培养的HK2细胞IDO表达升高并具有活性,推测病理状态下人肾小管上皮细胞诱导表达的IDO有可能参与了肾小管-间质的病理损害过程。

葡萄糖、胰岛素和尿酸对猪近端肾小管上皮细胞株血红素氧合酶-1的影响

目的观察不同浓度葡萄糖、胰岛素和尿酸的培养条件下猪近端肾小管上皮细胞株(LLC-PK1)血红素氧合酶(HO-1)活性的改变,以探讨代谢相关因素在细胞水平对肾小管上皮细胞的影响。方法以LLC-PK1为研究对象,观察葡萄糖浓度为5、10、22、33 mmol/L,胰岛素浓度为0、10-9、10-8、10-7mol/L,尿酸浓度为0、0.1、0.2、0.4 mmol/L培养48 h条件下,LLC-PK1细胞HO-1活性的改变。结果0.1 mmol/L0、.2 mmol/L和0.4 mmol/L尿酸刺激48 h后,LLC-PK1的HO-1活性增加,并呈剂量依赖关系,而上述浓度的葡萄糖和胰岛素刺激48 h对LLC-PK1的HO-1活性无影响。结论一定浓度的尿酸可使LLC-PK1的HO-1活性升高,提示尿酸在细胞水平对肾小管上皮细胞的氧化应激过程产生影响。

促红细胞生成素对高糖诱导大鼠近端肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:研究促红细胞生成素(EPO)对高糖诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)转分化(EMT)的影响及其分子机制。方法:在25 mmol/L浓度葡萄糖培养基中培养NRK52E,建立高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT模型。实验分为正常对照组(NC组)、甘露醇对照组(OC组)、高葡萄糖浓度组(HG组)、HG+EPO 50 U/ml组(E1组)以及HG+EPO 100 U/ml组(E2组)。其中NC组培养在正常环境中,OC组培养在19.5 mmol/L甘露醇环境中,其余三组培养在高糖环境中,且E1、E2组按要求添加相应浓度的EPO。RT-PCR检测促红素受体(EPOR)、E钙粘蛋白(E-cadherin)及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA) mRNA的表达,Western blot检测EPOR、E-cadherin及α-SMA蛋白表达;荧光探针检测胞内活性氧(ROS)水平。结果:高糖培养成功诱导NRK52E细胞EMT模型,相较于NC组,HG组细胞EPOR、α-SMA表达增加,E-cadherin表达降低,细胞ROS水平显著增加(均P<0.05);EPO干预抑制NRK52E细胞EMT,与HG组比较,E1和E2组E-cadherin表达增加,α-SMA表达降低,细胞内ROS水平降低,且E2组变化更显著。结论:EPO可能通过EPO受体的介导,缓解高糖诱导的氧化应激,抑制高糖诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞表型转化。

miR-377调控THEM4对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT的作用

目的:探讨微小RNA-377(miR-377)对硫酯酶超家族成员4(THEM4)的靶向作用及对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞上皮间充质转化(EMT)的影响。方法:将人近端肾小管上皮细胞HK-2分为正常葡萄糖组(NG组:5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG组:30 mmol/L葡萄糖)、HG+miR-NC组(HG+转染miR-NC)、HG+miR-377组(HG+转染miR-377)、HG+antimiR-NC组(HG+转染anti-miR-NC)、HG+anti-miR-377组(HG+转染anti-miR-377)、HG+miR-377+pcDNA3.1组(HG+共转染miR-377+pcDNA3.1)、HG+miR-377+pcDNA3.1-THEM4组(HG+共转染miR-377+pcDNA3.1-THEM4)、HG+miR-377+si-NC组(HG+共转染miR-377+si-NC)和HG+miR-377+si-THEM4组(HG+共转染miR-377+si-THEM4)。qPCR检测miR-377表达,Western blot检测Vimentin、E-cadherin、THEM4蛋白表达,生物信息学预测和双荧光素酶实验分析miR-377与THEM4的靶向关系。结果:与NG组相比,HG诱导的HK-2细胞中miR-377表达量、Vimentin蛋白表达量明显增加,E-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)。与HG+miR-NC组相比,HG+miR-377组HK-2细胞的miR-377表达量、Vimentin蛋白表达量显著升高,E-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)。与HG+anti-miR-NC组相比,HG+anti-miR-377组HK-2细胞中miR-377表达量、Vimentin蛋白水平显著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达量显著升高(P<0.05)。miR-377靶向调控THEM4表达。与HG+miR-377+pcDNA3.1组相比,HG+miR-377+pcDNA3.1-THEM4组HK-2细胞中THEM4、E-cadherin蛋白水平明显升高,Vimentin蛋白表达量显著降低(P<0.05)。与HG+miR-377+si-NC组相比,HG+miR-377+si-THEM4组HK-2细胞的THEM4、E-cadherin蛋白表达量明显降低,Vimentin蛋白水平明显升高(P<0.05)。结论:miR-377通过靶向THEM4调控高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT。

氨磷汀通过上调PKM2表达增强肾近端小管上皮细胞抵抗顺铂毒性

目的探究氨磷汀缓解顺铂肾毒性的分子机制。方法在肾近端小管上皮细胞系HK-2及原代细胞中,采用CCK-8细胞活性实验检测氨磷汀对顺铂细胞毒性的抑制作用。通过在线数据库tabula-muris分析肾脏组织各细胞亚群PKM2的表达。通过流式细胞术检测细胞凋亡比例。通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测细胞中PKM2基因表达。通过小RNA干扰技术敲低细胞中PKM2基因表达。结果氨磷汀显著增强HK-2细胞和原代肾近端小管上皮细胞抵抗顺铂的毒性。在顺铂处理的细胞中,随着氨磷汀浓度的增加,细胞的活力从0.37增加到0.45至0.77(P<0.001)。另外,随着氨磷汀浓度的增加,HK-2细胞中PKM2基因表达依次增加,在1μmol/L浓度时增加到8.76倍(P<0.001)。在HK-2细胞中干扰PKM2基因表达,氨磷汀对顺铂的细胞毒性的保护作用显著受到抑制。顺铂诱导的细胞凋亡比例、标志蛋白Cleaved-PARP和Cleaved-caspase3的表达被氨磷汀显著抑制。单细胞数据分析的结果表明,相对于肾脏组织其他细胞亚群,PKM2在肾近端小管上皮细胞中表达最低。结论氨磷汀通过上调肾近端小管上皮细胞PKM2的表达抑制顺铂诱导的细胞凋亡,从而缓解顺铂的细胞毒性。

高糖通过血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1通路促进人近端肾小管上皮细胞合成纤连蛋白

目的 研究血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1(SGK1)在高糖诱导人近端肾小 管上皮细胞(HKC)产生纤连蛋白(FN)中的作用,探讨SGK1在糖尿病肾病(DN)肾小管间质纤 维化中的作用机制。方法 将带有SGK1显性激活型突变体质粒(pIRES2-EGFP-S422DSGK1 mutant, SD)和带有SGK1显性失活型突变体质粒(pIRES2-EGFP-K127NSNSGK1 mutant,KN)分别瞬时转染 HKC;同时,设空质粒(pIRES2-EGFP,FP)转染组和未转染组(NT)为对照。分别用正常糖(NG, 5.5 mnlol／L D-葡萄糖)和高糖(HG,25 mmol/L D-葡萄糖)刺激8 h后,采用RT-PCR和Western 印迹来观察SGK1和FN的mRNA及蛋白的表达。结果 正常葡萄糖环境下转染SD和KN后, HKC合成的FN mRNA和蛋白的表达没有显著性改变。高糖环境下,转染SD的HKC与其它组 比较,其SGK1mRNA表达显著性增高(P<0.01),SGK1蛋白过度活化(P<0.01),其FN mRNA和 蛋白的表达显著增加(P<0.01)。转染KN的HKC与其它高糖组HKC比较,其活化的SGK1蛋 白显著减少(P<0.01),其合成FN mRNA和蛋白亦显著减少(P<0.01)。结论 高糖诱导HKC 的FN mRNA和蛋白的表达增加是依赖于SCK1的表达与活化,提示在DN中,高糖能通过SGK1 介导的信号通路来诱导人近端肾小管上皮细胞过度合成FN,促进肾小管间质纤维化。