烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-活性氧氧化应激信号通路在过敏反应中的作用及抗氧化剂干预实验研究

目的:探讨烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Noxs)-活性氧(ROS)氧化应激通路在过敏反应中的作用,并考察抗氧化剂对过敏反应的影响。方法:体外建立肥大细胞脱颗粒模型,将细胞分为空白组、阳性对照组[培养基中含有Compound48/80 (C48/80) 100μmol/L]和抗氧化剂组[培养基中含有C48/80 100μmol/L+二苯基氯化碘盐(DPI) 5μmol/L]。利用酶联免疫吸附试剂盒检测各组细胞胞内β氨基己糖苷酶(β-Hex)、组胺、超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化物(LPO)及炎症介质白细胞介素-4(IL-4)和IL-6水平。利用荧光染色及流式细胞仪检测胞内活性氧(ROS)水平。采用Western blot检测三组细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1、2、3、4(Nox1、Nox2、Nox3、Nox4)蛋白表达情况。结果:C48/80诱导大鼠原代嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3)释放β-Hex、组胺及炎症介质IL-4、IL-6,RBL-2H3细胞脱颗粒过程中胞内的SOD含量呈下降趋势,而LPO及ROS浓度升高。利用DPI处理脱颗粒的RBL-2H3细胞后,可以抑制胞内ROS水平,同时升高胞内SOD含量,降低LPO浓度,并且抑制了β-Hex、组胺、IL-4及IL-6的释放。当肥大细胞脱颗粒时,Nox1-4的蛋白表达均呈上升趋势,抗氧化剂DPI可以抑制这一反应。结论:阻断Noxs-ROS信号通路可以抑制过敏反应,抗氧化剂的应用为抗过敏提供了新的治疗思路。

血管外膜成纤维细胞及其还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶激活在血管损伤中的作用

血管外膜是血管壁最复杂的组成部分,血管外膜成纤维细胞(AF)是血管外膜主要的细胞成分,在血管的病理生理过程中发挥着重要作用。AF的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶激活与活性氧生成是多种血管损伤的始发阶段和共同机制。本综述对AF及其NADPH氧化酶、活性氧在血管损伤中的作用进行了总结。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-1基因重组真核表达质粒的构建及其对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的构建含人还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-1(NOX1)基因重组真核表达质粒,探讨其对血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响。方法通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库查找NOX1基因的mRNA序列,针对蛋白质编码区(CDS)设计引物,以人c DNA为模板扩增出NOX1基因全长CDS序列,经双酶切鉴定后,将NOX1基因与真核表达载体pc DNA3.1(+)连接,再经双酶切、测序鉴定。运用脂质体转染重组体pc DNA3.1(+)-NOX1至VSMC中,观察NOX1表达及VSMC凋亡情况。结果重组体中NOX1基因片段和载体DNA大小与预期一致。经BLAST(the basic local alignment search tool)比对,与NCBI数据库中的NOX1基因序列具有高度的同源性。pc DNA3.1(+)-NOX1能促进VSMC中NOX1蛋白高表达,并促使VSMC的凋亡。结论 NOX1基因重组真核表达质粒能促使VSMC凋亡,为阐明NOX1在主动脉夹层中的作用及分子机制研究奠定了基础。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2在局限性骨肉瘤组织中表达及与新辅助化疗效应及局部进展相关性研究

目的探讨局限性骨肉瘤组织还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)2表达与新辅助化疗效应及局部进展(L-PD)的相关性。方法选取自2005年1月至2016年12月收治的134例局限性骨肉瘤患儿(骨肉瘤组)及同期53例多指畸形患儿的软骨组织样本(参考组)进行回顾性分析。分别采用免疫组织化学法及蛋白质印迹法检测组织NOX2蛋白表达。采用Huvos分级系统评估新辅助化疗反应,RECIST标准评估L-PD情况。结果骨肉瘤组组织NOX2蛋白表达率及相对表达量均高于参考组,差异均有统计学意义(P<0.05),且两种检测结果基本一致。经受试者工作特征曲线(ROC)分析,组织NOX2蛋白相对表达量用于诊断骨肉瘤的曲线下面积(AUC)为0.746。组织NOX2蛋白高表达组病灶数目更多,且新辅助化疗反应不良的患儿比例更高(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线结果显示组织NOX2高表达者5年无L-PD时间短于低表达者(P<0.001)更高。同样地,单因素及多因素COX回归分析的结果显示组织NOX2蛋白高表达是骨肉瘤患儿5年L-PD预后不良的独立预测因子(P<0.001)。经ROC曲线分析,组织NOX2蛋白表达预测骨肉瘤患儿新辅助化疗反应不良及L-PD的AUC分别为0.774、0.774。结论组织NOX2蛋白表达对骨肉瘤患儿新辅助化疗不良及L-PD具有良好的预测效能,有望成为新型预测生物标志物。

高葡萄糖刺激血管内皮细胞尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4表达上调、活性氧增加及细胞凋亡

目的研究在高葡萄糖刺激的条件下,人脐静脉内皮细胞中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4的表达、细胞内活性氧以及细胞凋亡的变化。方法倒置显微镜下观察人脐静脉内皮细胞形态;免疫荧光法检测人脐静脉内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的表达;高葡萄糖刺激人脐静脉内皮细胞,用逆转录聚合酶链反应检测尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4mRNA水平,Western blotting检测尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4蛋白表达的变化,DCFH-DA检测细胞内活性氧生成量,流式细胞仪和Hoechst染色检测细胞凋亡。结果高葡萄糖刺激人脐静脉内皮细胞时,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4mRNA及蛋白表达上调,细胞内活性氧生成增加,细胞凋亡增加。结论高葡萄糖处理促进人脐静脉内皮细胞尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4表达上调并引起细胞内活性氧生成和凋亡增加。

高浓度氧暴露对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸表达的影响

目的探讨高浓度氧(高氧)暴露对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-脱氢酶亚基4(ND4)表达的影响。方法原代培养早产Sprague-Dawley(SD)大鼠AECⅡ,待其在含50mL/L二氧化碳(CO2)培养箱中生长至接近融合状态时随机分为高氧组和空气组。高氧组持续暴露于常压高浓度氧中,氧体积分数>900mL/L,CO2体积分数为50mL/L;空气组仍置于含50mL/L CO2培养箱中。二组分别于高氧或空气暴露6、12、24h提取细胞RNA,采取半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定ND4 mRNA的表达;采用免疫细胞化学染色法检测细胞爬片ND4蛋白的表达。结果与空气组比较,免疫细胞化学结果显示高氧暴露6、12h ND4的表达无显著性差异(Pa>0.05),高氧暴露24h ND4的表达显著减弱(P<0.05);RT-PCR检测显示高氧暴露6h ND4 mRNA表达无显著性差异(P>0.05),高氧暴露12、24h ND4 mRNA表达显著减弱(Pa<0.05)。结论高氧暴露下调早产SD大鼠AECⅡ ND4 mRNA和蛋白水平的表达,这种改变可能参与高氧肺损伤的发病过程。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶与心房颤动的研究

心房颤动是最常见的心律失常,其发生和维持的分子机制尚未明确。近年来发现心房颤动存在氧化应激,并已从动物实验、临床试验等多方面证实其主要来源为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶,推测NADPH氧化酶可能在心房颤动发生发展过程中起重要作用。以NADPH氧化酶为靶点的心房颤动干预措施如肾素-血管紧张素系统抑制剂和他汀类等也愈受关注。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶p22phox亚基与出血性脑卒中

近年来研究发现活性氧(ROS)所导致的氧化应激反应与出血性脑卒中的发生和发展有密切相关性。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶作为机体内皮细胞以及血管平滑肌细胞中活性氧最为重要的来源,在出血性脑卒中中扮演了重要角色。p22phox亚基是NADPH氧化酶的一个重要亚基,在传递电子及产生超氧阴离子方面起重要作用。

运动通过下调烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亚基改善糖尿病心肌病

目的:探讨链脲霉素诱导的糖尿病对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的影响,测定运动的干预效应。方法:SD大鼠糖尿病建模成功1周后,检测心室和心房肌中NADPH氧化酶亚基的表达以及心血管紧张素Ⅱ的表达,测定8周的运动能否有效影响NADPH亚基以及血管紧张素Ⅱ的表达。结果:糖尿病导致心室肌NADPH氧化酶亚基p67^(Phox)和gp91^(phox)表达增加,而8周运动能够抑制两种亚基表达的增加。糖尿病心房肌p67^(phox)增加显著,运动抑制其增加。糖尿病心血管紧张素Ⅱ水平显著增加,运动降低血管紧张素Ⅱ的增加。结论:运动降低糖尿病大鼠心肌p67^(phox)和gp91^(phox)表达的增加,这可能是改善心内基质的机制之一,因此运动治疗和预防糖尿病心肌病的一个有效机制可能是通过抑制心肌氧化应激和降低血管紧张素Ⅱ的表达。

NADPH氧化酶4在1型糖尿病模型小鼠角膜病变中的致病作用及其机制

目的探讨还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶4(Nox4)在1型DM模型小鼠角膜病变中的致病作用及其可能机制。方法选择Nox4基因敲除(Nox4^(-/-))纯合子雄性小鼠40只,以鼠龄、性别匹配的野生型C57BL/6(Nox4^(+/+))小鼠120只作为对照。采用随机数字表法分别将2种小鼠随机分为DM组和非DM组,DM组小鼠采用链脲佐菌素腹腔内注射法构建1型DM模型。采用随机数字表法分别将Nox4^(+/+)小鼠DM组和非DM组分为普通饲料喂养小鼠和添加Nox4抑制剂GKT137831(GKT)饲料喂养小鼠。于DM造模后第16周采用酚红棉线法检测各组小鼠泪液分泌量;采用荧光素钠染色评分法评估角膜上皮完整性;采用激光扫描共聚焦显微镜观察角膜基质层神经纤维密度变化;采用CellROX荧光探针检测角膜上皮中活性氧簇(ROS)含量;采用免疫荧光染色法检测小鼠角膜上皮中E-Cadherin蛋白和核因子-κB(NF-κB)蛋白表达变化;采用角膜铺片TUBB3染色法检测角膜中央区神经纤维密度。结果Nox4^(+/+)小鼠DM组和非DM组泪液分泌量分别为(2.40±1.18)和(5.30±1.02)mm/min,差异有统计学意义(P<0.01);Nox4^(-/-)小鼠DM组泪液分泌量为(4.19±0.63)mm/min,明显多于Nox4^(+/+)小鼠DM组,差异有统计学意义(P<0.05);普通饲料喂养小鼠与GKT添加饲料喂养小鼠DM组泪液分泌量分别为(2.23±0.83)和(4.02±0.71)mm/min,差异有统计学意义(P<0.01)。与Nox4^(+/+)小鼠非DM组比较,Nox4^(+/+)小鼠DM组角膜荧光素染色评分显著升高,角膜神经纤维密度显著降低,角膜上皮中ROS荧光强度明显增强,E-Cadherin蛋白表达荧光强度减弱,NF-κB蛋白表达荧光强度增强。Nox4^(-/-)或GKT添加饲料喂养小鼠DM组与非DM组比较角膜上皮中ROS荧光增强,E-Cadherin蛋白表达荧光减弱。Nox4^(-/-)和GKT添加饲料喂养小鼠DM组角膜上皮细胞中NF-κB蛋白荧光强度均较弱,与非DM组强度一致。角膜铺片免疫荧光染色显示,Nox4^(+/+)小鼠DM组中TUBB3染色的神经纤维密度明显低于非DM组,Nox4^(-/-)或GKT添加饲料喂养小鼠DM组角膜基质层神经纤维与非DM组比较无明显减少。结论Nox4参与了糖尿病角膜病变的致病过程,其机制可能与氧化应激诱导ROS产物聚集,激活NF-κB介导的炎症反应有关。

芦丁通过靶向烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4调控活性氧/低氧诱导因子-1α信号参与子宫内膜异位细胞增殖迁移侵袭及凋亡

目的探究芦丁对子宫内膜异位细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的作用及其可能的作用机制。方法人子宫内膜异位细胞CRL-7566经不同浓度芦丁作用不同时间后,采用CCK-8法检测细胞活性。CRL-7566细胞经烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)过表达质粒(ov-NOX4)转染后,给予70μM芦丁处理。CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖;划痕和transwell实验分别检测细胞迁移和侵袭;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹法(Western Blot)检测增殖相关蛋白表达;RT-qPCR和Western Blot检测转移、凋亡相关蛋白、NOX4及低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达;DCFH-DA荧光探针检测活性氧(ROS)水平。结果经芦丁处理后,CRL-7566细胞活性(71.06±0.61 vs.100.00±0.45)、克隆形成(38.38±2.71 vs.100.00±1.06)、迁移(46.04±2.95 vs.89.23±2.47)及侵袭能力(36.08±3.23 vs.135.33±6.49)降低,而凋亡能力(13.33±0.88 vs.4.54±0.57)增强,差异均有统计学意义(t=66.08、51.77、38.89、47.45及20.57,均P<0.05);且ROS生成减少(0.07±0.00 vs.1.00±0.06;t=40.45、P<0.05),NOX4 mRNA(0.28±0.06 vs.1.00±0.10;t=11.04、P<0.05)和蛋白表达(0.27±0.01 vs.1.00±0.05;t=33.56、P<0.05)、HIF-1α(0.39±0.05 vs.1.00±0.07;t=11.85、P<0.05)mRNA和蛋白表达(0.31±0.01 vs.1.00±0.05;t=31.02、P<0.05)降低。NOX4过表达可部分逆转芦丁对CRL-7566细胞活性(90.09±1.11 vs.70.92±0.72;F=585.00)、克隆形成(80.64±2.50 vs.41.85±0.80;F=2583.00)、迁移(65.41±1.54 vs.48.63±5.54;F=236.10)、侵袭(71.67±3.75 vs.35.42±2.94;F=1927.00)、凋亡(7.93±0.52 vs.13.32±0.85;F=198.00)、ROS生成(0.26±0.02 vs.0.07±0.01;F=1104.00)、NOX4 mRNA(0.63±0.03 vs.0.33±0.02;F=169.90)和蛋白表达(0.68±0.05 vs.0.29±0.02;F=510.60)及HIF-1αmRNA(0.64±0.06 vs.0.36±0.10;F=42.40)和蛋白表达(0.71±0.05 vs.0.29±0.01;F=508.00)的影响(均P<0.05)。结论芦丁可抑制子宫内膜异位细胞增殖、迁移及侵袭,并促进细胞凋亡,其机制可能与靶向NOX4并阻断ROS/HIF-1α信号有关。

川穹嗪对肾性高血压大鼠左心室肥厚和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的影响

目的研究川穹嗪(TMP)对肾性高血压大鼠的左心室肥厚及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的作用。方法用双肾双夹法建立肾性高血压大鼠模型,按照体重将大鼠随机分为5组:假手术组、模型组、低高2个剂量实验组(TMP,30,60 mg·kg^(-1)·d^(-1))、对照组(坎地沙坦,10 mg·kg^(-1)·d^(-1)),连续给药2周。颈动脉插管,检测血流动力学参数;试剂盒检测血清氧化应激指标;称取左心室重量,计算左心室体重指数(LVW/BW);以HE染色观察左心室组织的形态学改变;用逆转录聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法检测左心室脑钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的蛋白水平。结果治疗后低、高2个剂量实验组大鼠的主动脉收缩压和舒张压(AoSP,AoDP)、左心室收缩末压和舒张末压(LVESP,LVEDP)均显著降低,而室内压最大的上升速率(+dp/dt_(max))和下降速率(-dp/dt_(max))均显著升,高差异均有统计学意义(P<0.05)。给药后,与模型组的LVW/BW为(2.8±0.3)mg·g^(-1)比较,低、高2个剂量实验组和模型组分别为(1.9±0.2),(1.7±0.4)mg·g^(-1),差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较低、高2个剂量实验组的SOD显著升高而MDA和H_2O_2显著下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。给药后,低、高2个剂量实验组和模型组的左心室Nox2的蛋白表达分别为0.82±0.08,0.57±0.05,1.30±0.13,这3组的Nox4的蛋白表达分别为1.00±0.10,0.79±0.07,1.32±0.15,这3组的P47phox的蛋白表达分别为0.88±0.08,0.65±0.06,1.23±0.15,均较模型组显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 TMP可以改善肾性高血压大鼠的左心室肥厚,其机制可能与降低高血压大鼠左心室的NADPH(Nox2、Nox4及P47phox)蛋白表达、改善氧化应激有关。

慢性阻塞性肺疾病合并肺动脉高压患者血清活性氧和硫化氢水平及肺组织还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶-4和胱硫醚-γ-裂解酶表达及其意义

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重期患者血清活性氧(ROS)、硫化氢(H2S)水平,及COPD 稳定期患者肺组织中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶-4 (NOX4)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)表达及其意义.方法(1)选2015年11月至2016年12月在宁夏回族自治区人民医院呼吸科住院的COPD急性加重患者60例,根据是否合并肺动脉高压(PH)分为COPD急性加重合并PH组和COPD急性加重未合并PH组,另选同期健康体检者30例为健康对照组,采用酶联免疫法测3组受试者血清ROS、H2S水平.(2)收集2012年11月至2017年4月在宁夏回族自治区人民医院心胸外科因肺癌行肺叶切除42例患者的肺组织,根据是否合并PH分为COPD稳定期合并PH组和COPD稳定期未合并PH组、对照组,免疫组化法测3组患者肺组织NOX4、CSE表达,并观察肺小动脉壁厚度.结果(1)COPD急性加重合并PH组患者血清ROS水平[(613.52± 69.66)IU/ml]高于COPD急性加重未合并PH组[(565.76±71.33)IU/ml]、健康对照组[(294.63±60.39) IU/ml],COPD急性加重未合并PH组患者血清ROS水平高于健康对照组(P<0.05).COPD急性加重合并PH组患者血清H2S水平[(18.59±5.50)nmol/ml]低于COPD急性加重未合并PH组[(20.49± 4.97)nmol/ml]、健康对照组[(38.03±4.43)nmol/ml],COPD急性加重未合并PH组患者血清H2S水平低于健康对照组(P<0.05).ROS水平与肺动脉收缩压(PASP)呈正相关(r=0.59,P<0.05),H2S水平与PASP呈负相关(r=-0.62,P<0.05).(2)COPD稳定期合并PH组肺组织NOX4表达(0.08±0.01)高于COPD稳定期未合并PH组(0.06±0.01)、对照组(0.03±0.01),COPD稳定期未合并PH组肺组织NOX4表达高于对照组(P<0.05).COPD稳定期合并PH组肺组织CSE表达(0.03±0.01)低于COPD稳定期未合并PH组(0.07±0.02)、对照组(0.12±0.02),COPD稳定期未合并PH组肺组织CSE表达低于对照组(P<0.05). COPD稳定期合并PH组WT%[(40.58±6.63)%]高于COPD稳定期未合并PH组[(36.87±5.60)%]、对照组[(31.27±6.24)%],COPD稳定期未合并PH组WT%高于对照组(P<0.05).COPD稳定期合并PH组WA%[(32.33±6.27)%]高于COPD稳定期未合并PH组[(30.20±5.28)%]、对照组[(25.20±4.31)%],COPD稳定期未合并PH组WA%高于对照组(P<0.05).NOX4表达与WT%、WA%呈正相关(r值分别为0.81、0.66,P值均<0.05),CSE表达与WT%、WA%呈负相关(r值分别为-0.55、-0.39,P值均<0.05).结论 NOX4/ROS和CSE/H2S信号通路在COPD合并PH的发病机制中可能起重要作用.

脑缺血再灌注损伤与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的关系及其研究进展

脑卒中是目前世界上导致永久性残疾、痴呆及死亡的主要原因[1]。在中国,随着人口老龄化的加重,脑卒中的发病率正在不断提高,给整个医疗保健系统带来巨大负担。缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)是临床上最常见的脑卒中类型,约占其中的60%~80%,该病主要由突发血管内血栓形成引起的局部脑组织供血供氧不足所致[2-3]。目前尽早溶栓、恢复缺血脑组织血流灌注仍是急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)的唯一治疗策略。虽然随着血管内介入技术的应用和发展,再灌注治疗的安全性及血管再通率有了很大提高,但是由于治疗时间窗及相关禁忌的限制,这种方法在临床上只适用于少数患者,并且相当一部分接受再灌注治疗的患者预后不佳甚至死亡[4]。

槲皮素对兔缺血再灌注心肌还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、一氧化氮合酶基因和蛋白表达的影响

目的观察槲皮素对兔缺血再灌注心肌还原型炯酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NOX2）、一氧化氮合酶（NOS）基因和蛋白表达的影响。方法建立成年家兔心肌缺血再灌注模型，结扎左缘支30min，再灌注12h。实验分d组：空白对照组（contr01）、缺血再灌注组（I／R）、槲皮素组（Que）、槲皮素＋缺血再灌注组（I／R＋Que）。采用实时定量聚合酶链反应（Real-timePCR）和Westernblot方法检测心肌NOX2、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA和蛋白的表达。结果I／R组NOX2mRNA和蛋白表达分别为1．73±0．41、3．46±0．84，iNOSmRNA和蛋白表达分别为0．29±0．11、0．29±0．11，较对照组明显增高（P〈0．01），eNOS变化不明显（P〈0．01）。给予槲皮素后，Que组NOX2mRNA和蛋白表达分别为0．40±0．08、0．56±0．28，eNOSmRNA和蛋白表达分别为0．22±0．07、0．95±0．23，iNOSmRNA和蛋白表达分别为0．02±0．01、0．874-0．31；I／R＋Que组NOX2mRNA和蛋白表达分别为1．034-0．31、2．054-0．49，eNOSmRNA和蛋白表达分别为0．324-0．09、1．12±0．36，iNOSmRNA和蛋白表达分别为0．164-0．05、3．174-1．29；较对照组水平明显降低（P〈0．01）。结论心肌缺血再灌注后，NOX2、iNOS表达增加；槲皮素明显减少心肌缺血再灌注后NOX2、iNOS和eNOS的表达。

大蒜素激活核因子E2相关因子信号通路并抑制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶抗脑缺血再灌注损伤作用机制研究

目的探讨大蒜素在大鼠脑缺血再灌注过程中对核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)信号通路和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的影响,研究其抗脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法将45只健康雄性8周龄SD大鼠随机分为假手术组、大脑中动脉阻塞(MCAO)模型组和大蒜素处理组。脑缺血2 h,再灌注48 h后进行神经功能评分,四氮唑红(TTC)染色检测脑梗死体积,酶联免疫吸附(ELISA)等方法检测脑皮质中超氧化物、丙二醛(MDA)、蛋白羰基化和8-羟脱氧鸟苷(8-OHd G)水平,采用蛋白印迹法(Western blotting)测定脑皮质核内Nrf2、血红素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化还原酶(NQO-1)以及NADPH氧化酶亚基gp91-phox和p47-phox的蛋白表达水平。用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和Bonferroni’s检验。结果与假手术组(0 mm3)比较,MCAO模型组脑梗死体积[(204.6±24.8)mm3]明显增加,大蒜素组脑缺血再灌注诱导的脑梗死体积[(105.6±18.9)mm3]较MCAO模型组明显减少,差异均有统计学意义(P<0.01)。与假手术组(0分)比较,MCAO模型组大鼠神经功能缺损评分[(4.8±0.2)分]增加,与MCAO模型组比较,大蒜素处理组神经功能缺损程度[(2.5±0.5)分]明显减低,差异均有统计学意义(P<0.01)。与假手术组比较,MCAO组大鼠脑皮质超氧化物水平、MDA、蛋白羰基化和8-OHd G水平均明显增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。大蒜素处理组与MCAO组比较,以上4项指标水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。与假手术组比较,MCAO组大鼠脑皮质NADPH氧化酶亚基gp91-phox和p47-phox的蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05),而核内Nrf2以及HO-1和NQO-1的蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。与MCAO模型组比较,大蒜素能显著降低大鼠脑皮质NADPH氧化酶的亚基gp91-phox和p47-phox的蛋白表达,增加核内Nrf2以及HO-1和NQO-1的蛋白表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。大蒜素处理组的HO-1和NQO-1的活力较假手术组及MCAO组显著增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论大蒜素具有显著的抗脑缺血再灌注损伤作用,可能的作用机制是大蒜素能够激活Nrf2信号通路,并抑制NADPH氧化酶的表达和活力,从而抑制脑缺血再灌注诱导的氧化应激。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4阻断剂对糖尿病神经病变大鼠坐骨神经凋亡的影响

目的探讨糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠坐骨神经烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nox4)表达改变及Nox4阻断剂VAS2870对DPN大鼠坐骨神经凋亡的影响。方法40只8周龄雄性SD大鼠,平均体重(203.5±6.4)g,30只大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ),其中20只患糖尿病,余10只大鼠淘汰;其余大鼠腹腔注射等体积柠檬酸溶液作为对照组(n=10)。8周后糖尿病大鼠建立DPN模型,采用随机数字表法将DPN大鼠分为2组,VAS2870组(n=10,尾静脉注射VAS28701 mg/kg,每日1次,共7 d)和DPN组(n=10,尾静脉注射等体积0.9%无菌NaCl溶液,每日1次,共7 d)。用PowerLab数据记录分析系统检测坐骨神经运动神经传导速度(MNCV)和感觉神经传导速度(SNCV),用荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)检测坐骨神经Nox4、半胱氨酸天冬酶-3(caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA表达,用蛋白印迹检测坐骨神经Nox4、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平,采用单因素方差分析比较各组间的差异,用Tukey检验进行两两比较。结果DPN大鼠坐骨神经MNCV[(41.21±7.36)m/s]及SNCV[(30.39±7.66)m/s]均低于VAS2870组[(49.14±8.67)m/s,(38.95±6.24)m/s],VAS2870对MNCV及SNCV的下降具有减轻作用(q=3.58,4.53;均P<0.05)。DPN大鼠坐骨神经Nox4(4.72±0.42)、caspase-3(5.02±0.43)、Bax(5.63±0.82)mRNA(q=7.02,6.40,7.65;均P<0.05)及蛋白水平(0.86±0.10,0.78±0.17,0.95±0.13,q=7.83,9.15,6.87;均P<0.05)较对照组mRNA(5.79±0.53,6.90±0.79,7.39±0.67)及蛋白水平(0.59±0.13,0.45±0.14,0.64±0.14)表达上调,Bcl-2 mRNA(6.81±0.60,q=6.31,P<0.05)及蛋白水平(0.44±0.12,q=6.20,P<0.05)表达下调。VAS2870组Nox4、caspase-3、Bax mRNA(5.31±0.44,5.71±0.60,6.41±0.95)(q=3.66,2.98,4.02,3.38;均P<0.05)及蛋白水平(0.72±0.13,0.60±0.18,0.79±0.15)(q=4.24,5.78,3.83;均P<0.05)均低于DPN组,Bcl-2 mRNA(6.29±0.47)的及蛋白水平(0.56±0.12)表达均高于DPN组(q=3.38,2.81;均P<0.05),VAS2870部分逆转了Nox4、caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白的表达水平。结论DPN大鼠坐骨神经Nox4表达水平增高,通过调节凋亡相关蛋白caspase-3、Bax及Bcl-2表达促进坐骨神经凋亡;Nox4阻断剂通过减轻坐骨神经凋亡发挥恢复DPN大鼠坐骨神经传导速度的作用。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶介导骨形态发生蛋白4引起大鼠肺动脉平滑肌细胞内经典瞬时受体电位通道蛋白1和6上调

肺动脉高压（ pulmonary artery hypertension, PAH）是一类以静息状态下平均肺动脉压（mean pulmonary arterialpressure ,mPAP） ≥ 25 mmHg（ 1 mmHg =0. 133 kPa）为特征的疾病。其涉及疾病广，危害大，且缺乏有效的治疗手段。近年来对PAH的研究取得了较大的进展，但其发病机制仍不十分清楚。

尿酸上调肾小管上皮细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶蛋白水平对肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的观察不同水平尿酸对体外培养的肾小管上皮细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)及活性氧簇(ROS)的影响,探讨尿酸损害肾小管上皮细胞的可能机制。方法分离肾小管上皮细胞,将其分为对照组与尿酸干预组(尿酸干预组又分0.1、0.2、0.4、0.8 mmol.L-14个亚组),每组重复6孔;紫外分光光度法测定肾小管上皮细胞内NADPH蛋白水平;光泽精化学发光法测定肾小管上皮细胞内超氧阴离子(O—2)生成量;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)与琼脂糖凝胶电泳法检测肾小管上皮细胞凋亡。结果 24 h后,0.1 mmol.L-1尿酸干预组NADPH酶蛋白水平与O 2—生成量较对照组仅轻微增高,0.2、0.4、0.8 mmol.L-1尿酸干预组NADPH酶蛋白水平与O2—生成量均较对照组显著增高(Pa<0.01)。对照组细胞均未形成明显的DNA凋亡梯带,0.1、0.2、0.4、0.8 mmol.L-1尿酸干预组均可见明显的DNA凋亡梯带,0.4、0.8 mmol.L-1尿酸干预组DNA凋亡梯带较0.1、0.2 mmol.L-1尿酸干预组更为明显。TUNEL结果显示:对照组,0.1、0.2、0.4、0.8 mmol.L-1尿酸干预组的凋亡率分别为(17.5±1.0)‰、(72.4±12.4)‰、(136.8±13.4)‰、(328.7±32.6)‰、(427.2±51.5)‰,0.1、0.2、0.4、0.8 mmol.L-1尿酸干预组细胞凋亡率均明显高于对照组(Pa<0.01),各尿酸干预组之间细胞凋亡率随着尿酸干预浓度的增高而增高;相关分析发现肾小管上皮细胞凋亡率与肾小管上皮细胞内NADPH酶蛋白水平及O2—生成量呈显著正相关(r=0.765、0.792,Pa<0.01)。结论肾小管上皮细胞在持续高尿酸的作用下,可激活细胞内NADPH酶蛋白表达,释放O—2,启动氧化应激级联反应,使肾小管上皮细胞持续受损而导致肾小管上皮细胞凋亡增加。

熊果酸对肝星状细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的影响

近年来研究表明，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）表达的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase，NOX）在肝纤维化发病中起关键作用。NOX产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）介导了各种促肝纤维化因子在HSC内的信号转导，有望成为抗肝纤维化的新靶点0]。熊果酸（ursolic acid）是从中药植物（如丹参、女贞子等）中提取的单体成分，