还原型辅酶Ⅱ组化方法的研究

为了提高还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶组化方法的效果和敏感性 ,选用合适的操作条件 ,观察和比较操作中各种参数改变对反应结果的影响。发现操作过程中各个环节和因素的变化均会不同程度地影响试验结果。为此对整个操作过程 ,从组织的取材、固定、切片、反应和反应后处理过程等操作步骤的最佳条件进行了探讨。

丙酸睾酮与5-羟色胺对老年大鼠脊髓腰骶段年龄相关还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶阳性体表达的影响

目的探讨丙酸睾酮与5-羟色胺对老年大鼠脊髓腰骶段年龄相关还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶阳性体(ANB)表达的影响。方法选择无特定病原体级的SD大鼠进行析因设计:即LC组(6月龄,无干预对照);LT组(6月龄,丙酸睾酮干预);LS组〔6月龄,5-羟色胺(HT)干预〕;MC组(21月龄,无干预对照);MT组(21月龄,丙酸睾酮干预);MS组(21月龄,5-HT干预);HC组(24月龄,无干预对照);HT组(24月龄,丙酸睾酮干预);HS组(24月龄,5-HT干预),每组8只。干预后,取大鼠脊髓腰骶段,观察ANB和一氧化氮合酶(NOS)的表达。结果 ANB和NOS主要分布在大鼠脊髓腰骶段背侧部,随着大鼠的衰老,ANB的表达逐渐增多。丙酸睾酮干预组ANB表达要明显少于对照组。5-HT干预组ANB表达与无干预对照组无明显变化。随着大鼠的衰老,NOS的表达逐渐增少。丙酸睾酮干预组NOS表达要明显多于对照组,5-HT干预组NOS表达与无干预对照组无明显变化。各组脊髓腰骶段ANB和NOS含量呈负相关。结论脊髓腰骶段ANB的出现与衰老有关,随着机体的老化ANB的表达逐渐增多。脊髓腰骶段ANB的出现可能与体内衰老过程中睾酮的减少存在一定的关系,补充丙酸睾酮可以减少衰老过程中ANB的出现;而补充5-HT则未见类似效果。

高浓度氧暴露对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸表达的影响

目的探讨高浓度氧(高氧)暴露对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-脱氢酶亚基4(ND4)表达的影响。方法原代培养早产Sprague-Dawley(SD)大鼠AECⅡ,待其在含50mL/L二氧化碳(CO2)培养箱中生长至接近融合状态时随机分为高氧组和空气组。高氧组持续暴露于常压高浓度氧中,氧体积分数>900mL/L,CO2体积分数为50mL/L;空气组仍置于含50mL/L CO2培养箱中。二组分别于高氧或空气暴露6、12、24h提取细胞RNA,采取半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定ND4 mRNA的表达;采用免疫细胞化学染色法检测细胞爬片ND4蛋白的表达。结果与空气组比较,免疫细胞化学结果显示高氧暴露6、12h ND4的表达无显著性差异(Pa>0.05),高氧暴露24h ND4的表达显著减弱(P<0.05);RT-PCR检测显示高氧暴露6h ND4 mRNA表达无显著性差异(P>0.05),高氧暴露12、24h ND4 mRNA表达显著减弱(Pa<0.05)。结论高氧暴露下调早产SD大鼠AECⅡ ND4 mRNA和蛋白水平的表达,这种改变可能参与高氧肺损伤的发病过程。

紫外分光光度法体外筛选5α-还原酶抑制药

目的:从天然产物中筛选5α-还原酶抑制药用于前列腺增生(BPH)的治疗。方法:从SD雄性大鼠前列腺组织中提取5α-还原酶,以睾酮为底物,加入还原型辅酶Ⅱ(NADPH),加入天然产物提取物建立酶反应体系,在37℃连续孵育,采用分光光度法在340 nm波长处检测辅酶NADPH 10 min内吸光度值变化,以前列康醇提物和生理盐水分别为阳性对照和阴性对照,筛选5α-还原酶抑制药,并对其活性成分进行初步确定。结果:8种天然产物中,槟榔、地榆提取物对5α-还原酶有一定抑制作用,且地榆醇提液,槟榔水提液和醇提液酶抑制活性较强。结论:紫外分光光度法操作简单、经济可行,适用于5α-还原酶抑制药的初步筛选。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在病毒感染中的作用

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)是磷酸戊糖途径的第一个限速酶,不仅能维持细胞内还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)和还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)的平衡,而且在维持细胞内氧化还原平衡中也起着重要作用。研究表明,G6PD活性的降低可导致细胞内的氧化还原平衡被打破,趋向于氧化态,这不仅会导致细胞生长和信号传递的失调,还会使机体对病毒更易感。然而,目前关于G6PD的变化对病毒感染易感性的影响还没有系统的文献报道。本文将对病毒感染与G6PD之间的关系进行综述。

甘油醛-3-磷酸对羊肉色泽稳定性和高铁肌红蛋白还原的影响

目的:甘油醛-3-磷酸(3-phosphoglyceraldehyde,GAP)是糖酵解过程的代谢产物,其能够在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的催化下,生成还原型辅酶I(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH),而NADH会通过促进高铁肌红蛋白的还原而提高宰后肌肉色泽的稳定性。但GAPDH催化GAP产生的NADH能否直接作用于高铁肌红蛋白的还原并不明确。因此,该研究的目的在于探究添加GAP对肉色稳定性的影响及其作用途径。方法:采用原位模型和离体模型,在原位模型中将GAP添加到羊肉样品中,测定色差值及NADH含量;离体模型中,提取羊心肌中的线粒体,分别与高铁肌红蛋白、GAP等共同孵育,测定高铁肌红蛋白的占比。结果:原位模型中,向羊肉中添加GAP,显著升高了样品的红度值和NADH含量。离体模型中,GAP与GAPDH共同孵育显著降低了高铁肌红蛋白的占比,并且会增加孵育体系的氧气消耗率。结论:添加GAP提高羊肉的色泽稳定性,是由于GAP在肉中GAPDH催化下生成的NADH能够直接被用于还原高铁肌红蛋白,进而延缓了高铁肌红蛋白的累积,肉色稳定性较高。

发酵液中酮基还原酶活性测定方法的构建

本研究以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为底物,还原型辅酶Ⅱ(NADPH)为辅酶,应用紫外-可见光分光光度计法测定发酵液中酮基还原酶活性,通过连续测定NADPH消耗量来计算酶活力,得到了最佳反应体系:NADPH浓度为0.2 mmol/L,COBE浓度为1.0 mmol/L,磷酸缓冲溶液浓度为100 mmol/L、p H值为6,反应温度为40℃。在此条件下平行检测5次酶活,相对标准偏差(RSD)为0.48%。此方法操作简便,耗时短,精确度高,重复性好,可作为发酵液中酮基还原酶活性测定方法加以推广。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏的红细胞抗氧化能力的研究

本文探讨了正常和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺乏的红细胞抗氧化能力的不同。结果显示,G-6-PD缺乏的红细胞还原型辅酶Ⅱ(NADPH)含量显著低于正常红细胞;正常红细胞受过氧化刺激后,其过氧化氢酶(Cat)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHpx)活性及NADPH含量均呈现先升后降的变化;G-6-PD缺乏的红细胞的Cat,GSHpx活性及NADPH含量则持续下降。揭示了G-6-PD缺乏的红细胞抗氧化能力不足。本文还对NADPH在红细胞抗氧化中所起的作用进行了探讨。

NADH对Aβ蛋白损伤PC12细胞转谷酰胺酶Ⅱ、Cyclin和G蛋白表达的调控

目的 探讨NADH对PC1 2细胞Aβ2 5 - 35 损伤后的修复作用。方法 采用细胞实验检测NADH对Aβ2 5 - 35 对鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC1 2细胞系细胞毒性作用的影响,并运用流式细胞仪对细胞周期蛋白、G蛋白和转谷酰胺酶Ⅱ含量进行分析。结果 NADH能够明显抑制Aβ2 5 - 35 对PC1 2细胞的毒性作用,上调细胞损伤后周期蛋白A和B1的表达及下调周期蛋白D1表达;上调G蛋白和转谷酰胺酶Ⅱ表达。结论 NADH抑制和修复Aβ2 5 - 35 对PC1 2的损伤与细胞周期蛋白、G蛋白和转谷酰胺酶Ⅱ调节有关。

蒙古沙鼠耳蜗一氧化氮合酶的胆碱能调节

目的 通过检测乙酰胆碱对蒙古沙鼠耳蜗中一氧化氮合酶 (nitricoxidesynthase ,NOS)的影响 ,初步探讨耳蜗中NOS的调节机制。方法 蒙古沙鼠耳蜗经还原型辅酶Ⅱ -黄递酶 (NADPH -黄递酶 )染色后行耳蜗铺片 ,分别以同一动物两侧耳蜗为实验组和对照组进行对比观察 ,检测乙酰胆碱 (ACh)对耳蜗NOS活性的影响 ,其染色深度的差异通过HPIAS - 10 0 0高清晰度彩色病理图像免疫组化测量系统判断。结果 蒙古沙鼠耳蜗外毛细胞基底部传出神经末梢呈现NADPH -黄递酶染色阳性反应 ,ACh处理后染色深度明显增强 ,其平均灰度值从 74.2 8± 11.71减低至 46 .5± 7.78(P <0 .0 1)。结论 蒙古沙鼠耳蜗外毛细胞基底部的传出神经末梢可见NOS分布 ,ACh能增强其活性 。

大鼠耳蜗一氧化氮合酶的分布和表达

目的 本实验先用组织化学法 ,通过观察还原型辅酶Ⅱ -黄递酶 (NADPH -黄递酶 )的活性了解一氧化氮合酶 (nitricoxidesynthase ,NOS)在大鼠耳蜗内分布。再用亲合免疫细胞组织化学技术 ,研究大鼠耳蜗内神经元型NOS(neuronalNOS ,nNOS)与内皮型NOS(endothelialNOS ,eNOS)的表达。方法 组化组大鼠耳蜗切片用辅酶Ⅱ孵育液在 37℃条件下孵育 1小时。免疫组化组大鼠耳蜗切片经消除内源性过氧化物酶 ,3%山羊正常血清封闭非正常结合点后 ,用兔抗nNOS抗体、兔抗eNOS抗体 ,室温下孵育 6 0分钟 ,再用生物素标记的山羊抗兔第二抗体孵育、滴加ABC试剂 ,以DAB试剂显色。结果 大鼠耳蜗血管球内皮细胞有明显NADPH -黄递酶活性 ,血管纹及螺旋神经节细胞也有NADPH -黄递酶活性反应。大鼠耳蜗内、外毛细胞、螺旋神经节细胞nNOS、eNOS的表达呈阳性。血管纹细胞处有阳性nNOS、eNOS的表达。耳蜗血管球的内皮细胞无nNOS的表达 ,但eNOS的表达呈强阳性。

豚鼠耳蜗─氧化氮合酶的分布

目的 用组织化学法，通过观察ＮＡＤＰＨ－黄递酶的活性了解一氧化氮合酶在豚鼠耳蜗内分布。方法 经４％多聚甲醛心脏灌注固定后，取出耳蜗，经３％依地酸脱钙后，作厚１０μｍ冰冻切片，用辅酶Ⅱ孵育液在３７℃条件下孵育１小时。结果 发现在耳蜗内、外毛细胞底部与耳蜗神经末梢接头处及毛细血管球内皮细胞有明显ＮＡＤＰＨ－黄递酶活性，此外在内、外柱细胞、支持细胞、血管纹及螺旋神经节细胞也有ＮＡＤＰＨ－黄递酶活性反应。结论 ＮＯ在维持耳蜗正常神经传导及毛细血管张力中起着重要作用。

Nrf2-ARE通路在帕金森病大鼠黑质中的表达改变

目的观察由鱼藤酮制备的帕金森病(PD)大鼠模型黑质多巴胺能神经元中氧化应激参数、转录因子NF-E2相关因子(Nrf2)及其基因产物血红素氧合酶1(HO-1)和依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1(NQO1)的表达变化情况。方法将健康成年雄性Wistar大鼠40只随机分为对照组和实验组,20只对照组大鼠给予背部皮下注射葵花油[1 m L/(kg·d)],20只实验组大鼠,按照2.0 mg/(kg·d)背部皮下注射鱼藤酮(鱼藤酮溶解在葵花籽油中)制备PD大鼠模型,共30 d。最后一次注射结束后实验大鼠迅速断头取材,采用分光光度法检测大鼠脑内纹状体中丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量变化,采用Western blot检测两组大鼠中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1的表达。结果对照组和实验组脑内纹状体中MDA含量分别为(6.51±1.45)、(18.13±2.14)nmol/mgprot,与对照组比较,实验组大鼠纹状体中MDA升高了64.09%(P<0.01)。对照组和实验组纹脑内状体中GSH含量分别为(44.53±4.71)、(26.41±2.52)mg/gprot,与对照组比较,实验组大鼠纹状体中GSH降低了40.69%(P<0.01)。对照组大鼠中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1与β-actin免疫印迹条带相对吸光度比值分别为(0.81±0.05)、(0.84±0.07)和(0.91±0.15),实验组大鼠中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1与β-actin免疫印迹条带相对吸光度比值分别为(0.42±0.06)、(0.49±0.03)和(0.33±0.04)。与对照组比较,实验组大鼠黑质神经元中Nrf2、HO-1和NQO1表达分别降低了48.15%、41.67%和63.74%(P<0.01)。结论氧化应激在PD发病中起着非常重要的作用,内源性抗氧化损伤通路Nrf2-ARE与PD的发病关系密切,可能是PD新的治疗靶点。

芳香酶在雄性生殖中的功能及调节机制的研究进展

在男性哺乳动物体内,雄激素对生殖系统的发育至关重要,除此之外,一定水平的雌激素对于维持正常的精子发生也是必不可少的.雌激素主要调节精子发生的两个环节：精子的数量和精子的成熟.在男性生殖系统内,雌激素由雄激素转化而来,而芳香酶是催化该过程的关键酶.芳香酶是由两部分组成的微粒体酶复合物,第 1 部分被称为细胞色素 P450 芳香酶（cytochrome P450 aromatase,P450arom）,是由特异基因编码的糖蛋白,负责结合到类固醇底物并起催化作用;第 2 部分是一个普遍存在的、非特异编码的黄素蛋白,即还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）细胞色素 P450 还原酶,负责将 NADPH 上的电子转移到P450arom[1],通常所说的芳香酶是指P450arom.现对芳香酶在睾丸的表达分布、雄性生殖功能的影响以及芳香酶表达的调节机制 3 个方面进行综述.

L-02细胞中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶活性检测方法的建立及应用

目的建立L-02细胞中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-Co A)还原酶活性的检测方法。方法色谱柱:C18色谱柱,流动相:甲醇-水(20μmol·L-1磷酸二氢钾,p H 7.2)=6∶94,检测波长:340 nm,柱温:25℃,流速:1m L·min-1。考察该方法的专属性、标准曲线和定量下限、精密度与回收率、稳定性。结果还原型辅酶Ⅱ线性范围为2.5~1000μmol·L-1,定量下限为0.5μmol·L-1,日内、日间RSD分别在(5~6)%和(4~8)%内,相对回收率在(96.97~99.57)%内。结论建立的L-02细胞中HMG-Co A还原酶活性检测方法符合实验要求,且可用于测定氟伐他汀对L-02细胞HMG-Co A还原酶活性的抑制作用。

西地那非可抑制海绵体血管平滑肌细胞中烟碱和肿瘤坏死因子-α引起的PDE-5上调

在勃起前，PDE-5水解cGMP为无活性的GMP，导致NO减少，还原型辅酶Ⅱ氢化酶引起PDE-5上调和过氧化物增多，因而促进ED的发生。为评价阴茎海绵体血管平滑肌细胞内PDE-5和还原型辅酶2氢化酶之间是否存在联系，同时研究PDE-5抑制剂西地那非的活性，确定肿瘤坏死因子-α和烟碱在超氧化物产生和PDE-5表达的作用，

消化性溃疡患者胃壁一氧化氮合酶神经组化分布

近年研究证实,一氧化氮是胃肠非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经的一种新的抑制性递质,主要介导平滑肌的松弛效应,对维持胃粘膜正常血供、胃壁的正常运动有重要意义。NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成。NADPH硫辛酰胺脱氢酶(NADPH-diaphorase,ND)组织化学方法是一种间接证实NOS的存在部位(主要是神经成分)的较常用方法。我们应用该方法观察了8例消化性溃疡(PU)患者胃壁内NOS的分布情况并探讨其意义。 1 材料和方法 1.1 材料 PU患者胃大切新鲜手术标本8例,其中幽门管溃疡6例,幽门管、十二指肠球部复合性溃疡2例,年龄36岁～56岁,均为男性,取新鲜手术标本胃体大弯(正常部位)、幽门管(溃疡基底部及周边)各取1.0cm×1.0cm大小组织1块。

rAAV2-ND4基因玻璃体腔注射对Leber遗传性视神经病变的疗效评价

目的评价基因治疗Leber遗传性视神经病变(LHON)的安全性及临床效果。方法采用多中心前瞻性非随机对照临床试验研究设计,于2017年12月至2018年2月在十堰市太和医院眼科中心招募线粒体DNA 11778位点突变的LHON患者40例80眼,以视力较差眼或右眼(双眼视力相等时)行玻璃体腔内注射重组腺相关病毒2-还原型辅酶Ⅰ脱氢酶4(rAAV2-ND4),对侧眼作为未注射眼,并依此分为注射眼组和未注射眼组,每组40眼。分别于术前和术后1、3、6、12个月采用两用对数视力表测量患者最佳矫正视力(BCVA);采用非接触眼压计测量眼压;采用裂隙灯显微镜观察眼前节表现;采用CR-2免扩瞳眼底照相机检查眼底情况。对注射眼组与未注射眼组基因治疗前后视力、眼压变化及并发症发生情况进行比较。评估治疗有效率,以BCVA提高≥0.3 LogMAR为有效。结果40例患者中23例患者视力提高≥0.3 LogMAR,有效率为57.5%,其中注射眼组视力提高6眼,未注射眼组视力提高4眼,双眼同时提高者13例。未注射眼组和注射眼组治疗后12个月BCVA分别为(1.51±0.62)LogMAR和(1.62±0.58)LogMAR,较治疗前的(1.75±0.46)LogMAR和(1.83±0.47)LogMAR明显提高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。2个组BCVA总体比较差异无统计学意义(F组别=0.084,P=0.772);2个组治疗前后眼压总体比较差异均无统计学意义(F组别=0.557,P=0.575;F时间=2.314,P=0.106)。所有患者治疗后及随访期间均未发生严重并发症。结论rAAV2-ND4基因玻璃体腔内注射治疗LHON安全、有效,基因药物的单眼玻璃体腔内注射可以改善患者双眼视力。

糖尿病患者外周血白细胞磷酸戊糖途径代谢与呼吸爆发的关系

目的观察2型糖尿病患者外周血白细胞磷酸戊糖途径(PPP)关键酶———葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)活性、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)产量及呼吸爆发功能的变化,探讨糖尿病患者易感染的可能机制。方法检测2型糖尿病患者外周血白细胞G6PD活性、NADPH含量,并通过检测白细胞活性氧(ROS)产量观察其呼吸爆发功能,研究白细胞外不同浓度糖环境对细胞呼吸爆发功能的影响。结果与正常人比较,糖尿病患者外周血白细胞G6PD活性、NADPH产量及ROS含量均明显降低。结论血糖控制不良引起糖尿病患者白细胞内PPP途径代谢紊乱,G6PD活性下降从而导致其白细胞呼吸爆发功能障碍,这可能是糖尿病患者易于感染的主要原因之一。