番茄顺式还原酮加双氧酶基因家族分析及功能鉴定

顺式还原酮加双氧酶(acireductone dioxygenase, ARD)是Cupins蛋白家族的一员,在原核生物和真核生物中广泛存在,主要参与甲硫氨酸代谢途径的催化;另外,植物中甲硫氨酸代谢途径与乙烯和多胺等的合成密切相关,且乙烯和多胺参与了植物生长发育和逆境胁迫响应等多种生物学过程。植物中关于ARD的研究报道有限,尤其是园艺作物。番茄在人们的日常饮食结构中占有重要比例,也是植物研究领域常用的模式植物之一。本研究以番茄(Solanum lycopersicum)为研究对象,鉴定番茄基因组中包含的SlARD成员,并利用生物信息学分析手段、定量PCR技术和亚细胞定位等实验,对番茄SlARD基因家族进行分析及功能鉴定。结果表明,番茄基因组中共包含2个SlARD成员,分别命名为SlARD1和SlARD2,二者均定位于番茄第9号染色体,与拟南芥(Arabidopsis thalina)AtARD家族成员存在一定的系统发育和进化关系;SlARD1/2均只包含1个ARD结构域;番茄SlARD1/2在根、茎、叶中均有表达,能够响应水涝胁迫,定位于细胞质和细胞核。本研究还对结合SlARD1和SlARD2启动子的转录因子和SlARD1/2的互作蛋白网络进行了预测。上述实验结果能够为番茄SlARD的功能和分子机理研究提供理论参考和实验依据。

白花丹参顺式还原酮加双氧酶基因的克隆、分子特征和表达调控分析

目的:获得白花丹参参与乙烯和多胺合成的顺式还原酮加双氧酶(acireductone dioxygenase,ARD)基因(命名为SmARD)序列,并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究。方法:利用全长cDNA文库技术,从两年生白花丹参根中获得目的基因SmARD序列。利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找该基因的开放读码框,prosite分析蛋白质的基本结构域。用半定量RT-PCR检测其在白花丹参幼苗根、茎、叶和成花中的表达情况。结果:得到688 bp的SmARD基因全长序列。具有一个591 bp的开放读码框,编码196个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量23.27 kDa。使用预测的SmARD蛋白序列在NCBI中进行蛋白保守域分析,发现SmARD与ARD/ARD′家族具有很高的同源性。半定量RT-PCR表明,SmARD在白花丹参幼苗根、茎、叶和成花等组织中均有转录水平的表达,但是在根部表达最强。水分亏缺处理3 d,150 mmol.L-1NaCl处理1 d,4℃低温处理1 d和100μmol.L-1ABA处理1 d均抑制SmARD的表达,100μmol.L-1茉莉酸甲脂(MJ)和10μmol.L-1乙烯利(ETH)处理1 d诱导SmARD的表达。结论:首次得到白花丹参的顺式还原酮加双氧酶(ARD)基因序列,为其参与白花丹参响应逆境和次生代谢产物合成的信号调节功能研究奠定了基础。

黄酮类化合物抑制β-酮酰基-ACP还原酶的构效关系研究

研究黄酮类化合物对β-酮酰基-ACP还原酶(FabG)的抑制能力和分子结构之间的关系,并探讨其抑制作用机制。通过体外酶活测定,系统评价了33种黄酮类化合物对FabG的抑制活性,分析了构效关系;采用分子对接的方法研究了黄酮类化合物对FabG的抑制作用模式,研究了木犀草素对FabG的抑制动力学特征。研究结果表明:在质量浓度为25 mg/L时,异银杏双黄酮、奥洛波尔和木犀草素对FabG的抑制率达50%以上,另有15种黄酮类化合物对FabG的抑制率大于20%。具有FabG抑制活性的黄酮类化合物基本结构特征是A环上C-5、C-7以及B环C-4'位同时存在羟基,C环具有C-4位羰基和C-2、C-3位碳碳双键。B环增加邻位羟基取代会提升其FabG抑制活性,C环C-3位羟基化会减弱抑制活性。分子对接结果表明:黄酮类化合物能通过氢键、π相互作用等结合力与FabG-NADP+复合物的酪氨酸-151(Tyr-151)、丝氨酸-138(Ser-138)等关键活性氨基酸残基产生结合作用。抑制动力学测定结果显示:木犀草素抑制FabG时与底物(EAA)是竞争性关系,与辅酶(NADPH)是反竞争性关系。黄酮类化合物通过与FabG-NADP+复合物结合,与底物竞争活性位点,从而对FabG产生抑制作用。黄酮类化合物的抑制FabG活性与其分子结构密切相关,主要活性基团为A环和B环上的羟基取代基。

桂枝茯苓胶囊联合戈舍瑞林对子宫肌瘤大鼠模型醛酮还原酶1C3和内分泌的影响

目的观察桂枝茯苓胶囊联合戈舍瑞林对子宫肌瘤大鼠模型醛酮还原酶1C3(AKR1C3)和内分泌的影响。方法将36只7周龄雌性白细胞介素-2受体共同Υ链(IL2RG)大鼠随机分为空白对照组、模型对照组和联合治疗组,每组各12只。模型对照组和联合治疗组通过雌孕激素药物建立子宫肌瘤模型。造模结束后第2天,空白对照组和模型对照组予蒸馏水5 mL灌胃,联合治疗组予桂枝茯苓胶囊混悬液0.70 g/(kg·d)+戈舍瑞林1.25 mg/(kg·d)灌胃,连续6周。采用酶联免疫吸附法测定各组大鼠血清雌二醇、孕酮和催乳素水平,实时荧光定量聚合酶链式反应法检测AKR1C3 mRNA表达,蛋白免疫印迹法检测Ⅰ型胶原、转化生长因子β(TGF-β)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。结果与空白对照组相比,模型对照组雌二醇、孕酮和催乳素含量均升高(P<0.05);与模型对照组相比,联合治疗组雌二醇、孕酮和催乳素含量降低(P<0.05)。与空白对照组相比,模型对照组AKR1C3 mRNA表达含量升高(P<0.05);与模型对照组相比,联合治疗组AKR1C3 mRNA表达含量降低(P<0.05)。与空白对照组相比,模型对照组Ⅰ型胶原、PAI-1和TGF-β蛋白表达均升高(P<0.05);与模型对照组相比,联合治疗组Ⅰ型胶原、PAI-1和TGF-β蛋白表达均降低(P<0.05)。与空白对照组相比,模型对照组Caspase-3和Bax蛋白表达降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05);与模型对照组相比,联合治疗组Caspase-3和Bax蛋白表达升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。结论桂枝茯苓胶囊联合戈舍瑞林能降低子宫肌瘤大鼠雌二醇、孕酮和催乳素水平,抑制AKR1C3表达,具有抗增殖和促凋亡的作用,可抑制子宫肌瘤生长。

水稻白叶枯病菌酸性还原酮加双氧酶的鉴定分析

酸性还原酮加双氧酶(ARD)催化很多原核和真核生物中的甲硫氨酸急救途径(MSP)倒数第二步。本研究鉴定了水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)中的酸性还原酮加双氧酶,命名为xard。Xoo菌株PXO99A、MAFF311018和KACC10331中的xard核苷酸序列完全相同。xard基因突变菌株在甲硫基腺苷(MTA)为唯一硫源时不能正常生长。这一结果证明Xard在MSP中起作用。xard突变体和野生型菌株PXO99A接种水稻IR24后病斑长度数据表明该基因突变对Xoo在水稻上的毒性没有影响。

酮醇酸还原异构酶抑制剂的设计、合成及除草活性

酮醇酸还原异构酶(KARI)是一个有前景的除草剂靶标酶,有关其抑制剂的设计研究鲜有报道。在文献报道的菠菜KARI酶复合物0.165nm高分辨率晶体结构基础上,利用分子对接DOCK4.0方法进行MDL/ACD三维数据库搜寻,得到了279个与KARI酶结合能较低的小分子结构信息,并从中选取部分小分子进行化学合成,进而测试了其除草活性。在合成的17个化合物中,发现个别化合物对油菜(抑制率70.8%)和稗草(抑制率48.8%)具有较好的生长抑制活性。

大豆查尔酮还原酶基因CHR1的功能研究

为了验证查尔酮还原酶基因CHR1在大豆苷元合成中的作用,文章克隆了CHR1基因并构建了RNA干扰表达载体pCPB-CHR1-RNAi,将载体转化受体大豆品种"吉农28"中,以期抑制CHR1基因的转录。通过农杆菌介导的遗传转化和PCR检测得到4株T0代阳性植株,13株T1代阳性植株。Southern blotting结果表明,功能元件以单拷贝的形式整合到大豆的基因组中。利用实时荧光定量PCR法(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)测定CHR1基因在mRNA水平上的表达量,结果表明,转基因大豆植株中CHR1的表达量与未转化的受体大豆相比降低了60%～99%;高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)检测到合成大豆苷元过程中的前体物质异甘草素的含量降低了38.7%。该RNA干扰机制在转录水平上抑制了CHR1基因的表达。

除草剂靶标酮醇酸还原异构酶(KARI)研究进展

酮醇酸还原异构酶(KARI)是植物和微生物体内支链氨基酸生物合成的关键酶之一,可以作为设计除草剂的靶标,通过抑制酶的活性中断支链氨基酸的合成使植物死亡,达到除草目的。文章综述了KARI的催化性质、晶体结构以及作为除草剂靶标的研究现状。

苦荞类异黄酮还原酶基因(FtIRL)的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到类异黄酮还原酶基因(IRL)的开放阅读框序列(ORF),命名为FtIRL。序列分析表明:FtIRL含一个长942bp的ORF,编码313个氨基酸,其氨基酸序列与金荞异黄酮还原酶FcIFR(GenBank登录号ABV02071)同源性最高,达到97%;与其他植物IRL同源性为44%～73%。生物信息学分析表明:FtIRL推导的蛋白质含有典型的底物结合口袋和保守的NADPH结合位点,符合短链脱氢酶家族的结构特征。构建基于氨基酸的系统发育树表明,苦荞FcIFR虽然在氨基酸序列上与其他植物的异黄酮还原酶(IFR)有较高的同源性,但其生物学功能可能更接近落叶松脂醇还原酶(PLR)。

醛酮还原酶AKR7A1在活性醛引起的V79-4细胞损伤中的作用

目的探讨醛酮还原酶AKR7A1在活性醛引起的细胞损伤中的作用。方法采用AKR酶活性实验检测外源性AKR7A1蛋白在V79-4中国仓鼠肺细胞中的催化活性,使用caspase-3活性实验和基因突变致畸实验检测在V79-4细胞中过表达AKR7A1对活性醛引起的细胞凋亡和致畸作用的影响。结果 AKR酶活性实验结果显示:转染AKR7A1的V79-4细胞内还原酶活性显著升高,表明稳定表达的AKR7A1具有催化活性。caspase-3活性实验结果显示:稳定表达AKR7A1的V79-4细胞经10μmol/L丙烯醛处理后,caspase-3活性显著低于对照细胞。致畸实验结果显示:表达转空载体的V79-4细胞在4-羟基壬烯醛处理后的突变率显著高于稳定表达AKR7A1的V79-4细胞。结论稳定表达醛酮还原酶AKR7A1能显著提高V79-4细胞对丙烯醛引起的细胞凋亡和4-羟基-2-壬烯醛引起的致畸作用的抵抗力。

过表达醛酮还原酶AKR7A1对巴豆醛致畸作用的影响

目的:探讨过表达大鼠醛酮还原酶AKR7A1蛋白对巴豆醛致畸作用的影响。方法:使用Western blot法和醛酮还原酶(AKR)酶活性技术检测并鉴定外源性AKR7A1在V79-4细胞中的表达水平和催化活性,使用HGPRT基因突变实验检测在V79-4细胞中过表达AKR7A1对巴豆醛致畸作用的影响。结果:Western blot检测显示V79-4细胞中表达高水平的AKR7A1蛋白;AKR酶活性实验结果显示过表达的AKR7A1蛋白具有催化活性;HGPRT基因突变实验结果显示过表达AKR7A1的V79-4细胞对巴豆醛致畸作用的抵抗力明显高于对照细胞。结论:过表达大鼠AKR7A1能显著提高V79-4细胞对巴豆醛致畸作用的抵抗力。

甘蔗类异黄酮还原酶(IRL)基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术从甘蔗中克隆So IRL基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR技术研究So IRL基因在甘蔗不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。结果表明,克隆获得甘蔗So IRL,Gen Bank登录号为KF808324。该c DNA全长1 169 bp,含有1个927 bp的完整开放阅读框(ORF),编码309个氨基酸。系统进化树分析显示,甘蔗So IRL与玉米的IRL蛋白亲缘关系较近。q RT-PCR分析表明So IRL在甘蔗根、茎、叶中均有表达;在RSD病菌及低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、Na Cl和脱落酸(ABA)4种非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同。说明该基因可能参与甘蔗应答RSD过程,并可能在非生物胁迫中也发挥了作用。

人源醛酮还原酶7A2融合蛋白的纯化及其对苯代谢产物的催化活性

目的使用FPLC系统纯化人源醛酮还原酶(AKR)7A2融合蛋白,并检测纯化的AKR7A2蛋白对苯的代谢产物的催化活性。方法将含有His-AKR7A2的重组质粒转化至BL21大肠杆菌,通过IPTG诱导AKR7A2融合蛋白的大量表达;利用FPLC系统通过HiTrap亲和柱和G25 Sephadex凝胶色谱柱纯化AKR7A2融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定。采用酶活性实验检测纯化的重组AKR7A2蛋白对苯甲醛、双苯醌和反向,反向-2,4-二烯-1,6-己二酮(MUC)的底物特异性。结果使用FPLC系统通过两步纯化法成功获得重组的His-AKR7A2融合蛋白,纯度高达98%。酶活性实验结果显示:重组AKR7A2蛋白对苯甲醛有中等亲和力,对MUC亲和力较高,对双苯醌的亲和力较低。结论成功纯化了重组人源AKR7A2蛋白,并检测了其对3种苯代谢产物的底物特异性,AKR很可能在苯的代谢途径中扮演重要角色。

大豆异黄酮还原酶基因的鉴定及生物信息学分析

异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次级代谢产物，是大豆主要的功能活性成分之一。异黄酮还原酶（isoflavone reductase，IFR）是异黄酮分解途径的关键酶之一，在调控异黄酮含量及成分方面起着重要作用。本研究基于大豆全基因组测序数据，利用生物信息学方法鉴定了大豆异黄酮还原酶基因家族成员，并对其基因的序列特征、结构特征和遗传多样性进行了分析。结果表明：大豆异黄酮还原酶（GmIFR）家族含有17个成员，蛋白序列介于191（GmIFR07）和376（GmIFR11）个氨基酸之间，序列相似性为19．59％（GmIFR07和GmIFR11）-98．43％（GmIFR12和GmIFR17），结构分析表明这些基因内含子数目差异较大，2—6个不等，不均匀的分布在大豆的1、4、6、9、11、12和16号染色体上。

手性Salen-Co(Ⅱ)络合物催化芳香酮的不对称还原反应——推荐一个综合化学实验

介绍以Salen-Co(Ⅱ)络合物为金属有机催化剂的不对称芳香酮还原反应实验。通过本实验可了解有关手性、金属配合物催化剂的设计合成、催化机理、产率、选择性等基本概念,提高在手性化合物拆分及不对称催化方面的操作能力,加强在有机、无机合成、仪器分析、催化、手性分离及化合物表征等方面的综合能力。讨论了该实验在高年级本科生综合化学实验教学工作中的实践效果。

2-酮-L-古龙酸还原酶分离纯化及其理化、酶学性质的研究

从发酵Ｌ山梨糖的Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ和Ｂａｃｉｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ２９８０混和菌株的无细胞抽提液中分离到了２酮Ｌ古龙酸还原酶（ＫＧＲ），测得其分子量为９０ｋＤａ。动力学性质研究表明它为一个典型的ＭｉｃｈａｅｌｉｓＭｅｎｔｅｎ氏酶，对２酮Ｌ古龙酸作用的Ｋｍ值为３４２×１０－３ｍｏｌ，最适作用ｐＨ为６５，最适作用温度为３０℃。２酮Ｌ古龙酸还原酶的合成不受Ｌ山梨糖和２酮Ｌ古龙酸的诱导，故推测２酮Ｌ古龙酸还原酶是Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ的一个组成酶。

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的研究

将麦迪霉素产生菌基因文库中与放线紫红素酮基还原酶基因actⅢ有同源性的4.0kb DNA片段克隆到质粒载体pWHM3中,构成重组质粒pCB4。将质粒pCB4转入酮基还原酶基因缺陷菌株——加利利链霉菌ATCC31671中,得到转化子。转化子发酵产物经TLC和HPLC分析证明是阿克拉菌酮,与加利利链霉菌原株ATCC31133的产物相同,说明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因互补了加利利链霉菌ATCC31671中缺陷的酮基还原酶基因,使其恢复了产生阿克拉菌酮的能力。4.0kb DNA片段插入方向相反的重组质粒pCBR4在加利利链霉菌ATCC31671中发酵产物经TLC分析证明也是阿克拉菌酮,这说明4.0kbDNA片段中麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因具有自身的启动子。对4.0kb DNA片段进行了限制酶酶切分析,建立了其酶切图谱。以actⅢ基因为探针,经分子杂交以及亚克隆和DNA转化实验,将麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因定位于BssHⅡ-BamHⅠ1.3kb DNA片段上。对1.3kb DNA片段核苷酸序列分析结果表明:此1.3kb DNA片段中含有一个独立的ORF,起始密码ATG,终止密码TAG,含783bp;在起始密码上游有GGAGG5个核苷酸SD序列;此ORF编码260个氨基酸,与actⅢ基因编码的261个氨基酸相似性为77.4％,相同性为66.7％,对麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的可能作用进行了讨论。

二氢黄酮还原酶基因的克隆与转基因烟草的获得

以蒺藜苜蓿(Medicagotrunctulacv.5160)幼果总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆到二氢黄酮还原酶(DFR)基因的cDNA序列,所获得的cDNA序列全长1018 bp,具有完整的ORF,编码337个氨基酸。Blast分析表明,该片段与GenBank中注册的DFR基因同源性为99.80%。以植物表达载体pBI121为基础,构建了Ca MV35S启动子驱动的DFR基因植物表达载体pBIDFR;采用直接转化法将pBIDFR导入根癌农杆菌EHA105,用该菌株对普通烟草进行遗传转化获得6株转基因植株。

大豆查尔酮还原酶基因(Gmchr4)的克隆与功能鉴定

大豆查尔酮还原酶(chalcone reductase,CHR)是大豆苷元合成途径中必需的关键酶之一。在大豆基因组中分离到新的查尔酮还原酶基因Gmchr4,克隆基因cDNA片段长度为1 410bp(Gen Bank登录号:KF938604),含开发阅读框966bp,分析了Gmchr4在大豆基因组的进化关系。通过实时荧光定量PCR技术(Q-PCR)和高效液相色谱技术(HPLC)分析了基因的表达水平和催化产物异甘草素的含量。实验结果证明得到一种新的大豆查尔酮还原酶蛋白基因,为深入探索大豆苷元等异黄酮类化合物的生物合成途径,尤其是相关基因间的表达调控提供了参考。

产二羰基醛酮还原酶的1株嗜麦芽寡养单胞菌研究

用含甲基乙二醛的LB培养基平板筛选到1株能代谢甲基乙二醛的细菌,通过对克隆到的16S rDNA基因序列比对及生理生化实验,将其鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌,命名为Stenotrophomonas maltophilia YL.破碎该菌细胞后提取粗酶,以甲基乙二醛作反应底物,在还原性辅酶Ⅰ存在条件下,紫外光谱和HPLC的分析表明,该菌能代谢甲基乙二醛;并对其产酶条件进行了研究.紫外分光光度法测得酶活力表明,该菌有较强的醛酮还原酶活力;并对温度和pH值对酶活力的影响作了分析.