指数富集的配体系统进化技术研究进展及在食品检测中的应用

核酸适配体是指能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的寡核苷酸序列,可识别的靶分子范围非常广,并均可通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选得到。近年来,在传统SELEX技术的基础上,新的SELEX技术不断出现。这些新技术的出现,在不断完善SELEX技术的同时,也极大地推动了适配体技术在各学科领域中的发展及应用。本文对核酸适配体的筛选方法进行了总结,并介绍了其在食品检测领域的应用现状和发展方向,为核酸适配体的筛选与应用提供了参考。

指数富集的配基系统进化技术及其在血管研究中的应用

指数富集的配基系统进化技术是一种生物文库技术，它利用人工合成的、容量约为10^14-10^15的随机寡核苷酸文库与靶物质结合，经过多轮筛选获得靶物质的DNA或RNA适配子，具有实用范围广、筛选过程简便、适配子有高特异性和高亲和性等特点。在血管研究方面主要是针对血管内膜增生和新生血管形成开展的，在该领域发展潜力巨大。

利用细胞-指数式富集的配体系统进化技术筛选肿瘤细胞DNA适配子

目的建立一种通用的细胞-指数式富集的配体系统进化(Cell-SELEX)技术平台,用于筛选特异性结合于肿瘤细胞的DNA适配子。方法采用PCR法建立随机双链DNA(dsDNA)寡核苷酸文库,用卵白素包被的琼脂糖珠从dsDNA库分离单链DNA(ssDNA)文库;以体外培养的肿瘤细胞作为正筛选的靶标,以相同组织来源的正常对照细胞作为负筛选的靶标,消减法进行Cell-SELEX筛选和PCR扩增以获取DNA适配子;流式细胞仪监测适配子的富集效率(亲和力);采用常规分子生物学技术进行适配子的克隆、测序和序列分析。结果成功建立了ssDNA库,经过12轮Cell-SELEX筛选,获得了特异性结合于肿瘤细胞的DNA适配子;挑选120个阳性克隆送测序,鉴定出21个适配子,采用NCBI网站提供的Blastn程序进行精确比对未发现相似序列。结论本实验建立的技术平台可在较短时间内获取特异性结合于特定肿瘤细胞的DNA适配子。

复合靶指数富集的配基系统进化技术研究进展

核酸适配体是一类具有高度特异性和亲和力的单链寡核苷酸,被誉为"人工单抗",具有广阔的应用前景。它一般是通过指数富集的配基系统进化(SELEX)技术筛选获得。目前SELEX技术多局限于单一、纯化的可溶性蛋白质靶标。然而,蛋白质的纯化过程繁琐,耗时费力,而且很多靶标(如血清中的低丰度蛋白质或细胞的膜蛋白)很难纯化获得单一纯品。复合靶SELEX技术则可以避免靶标的纯化过程,能够保持靶标的天然构象,并且可以在未明确靶标的组成及结构特性的前提下,通过高通量的盲筛获得一系列特异性核酸适配体。该文主要介绍以未纯化的各种生物样本为复合靶的SELEX技术,以期为核酸适配体的筛选提供新思路。

指数富集的配体系统进化技术的发展及其在临床治疗中的应用

基于作为配基的寡核苷酸的三维立体结构,指数富集的配体系统进化(SELEX)技术能够筛选获得高效、特异结合靶分子的寡核苷酸适体。该配基由于其亲和力高、特异性强、免疫原性低、筛选周期短及适用范围广等特性,在临床诊断和疾病治疗中拥有多项优势,具有被研制成新型适体药物应用于临床的巨大潜力。本文从SELEX技术的发展、配基的修饰改造、临床治疗的优势、配基作为靶蛋白功能阻断剂和药物分子靶向载体进行的临床应用等几个方面,对寡核苷酸适体在临床疾病治疗中的应用进行综述。

红花金银花染色体核型及进化分析

采用常规制片方法对红花金银花(Lonicera syringantha Maxim.)的染色体进行核型分析。结果表明,红花金银花的染色体数目为18条,基数为9,染色体核型公式为:2n=18=2M+12m(2SAT)+2sm+2st,其中第3号染色体具随体,染色体相对长度组成为2n=18=4L+4M2+4M1+6S,核型属于"2B"型,核型不对称系数为63.12%,属于由对称向不对称演化的过渡型;同时对核型的4个重要性状进行了分析,结果表明,红花金银花的进化指数为8,进化程度较高;表明红花金银花是较野生金银花进化的类型。

B淋巴细胞活化因子特异的单链DNA适体的人工进化

目的:进化筛选与B淋巴细胞活化因子(B cell activating factor be longing to the TNF family,BAFF)特异结合的单链DNA适体,鉴定其结合力。方法:应用指数方式富集的配体系统进化(systemati cevolution of ligands by exponential enrich-ment,SELEX)技术,将随机序列寡核苷酸文库与BAFF分子相互作用,分离出结合的寡核苷酸配体,经反复扩增、筛选数个循环,获得重组人BAFF的单链DNA适体,应用Dot blotting鉴定其结合力,酶联法比较各适体序列对BAFF的相对结合力。结果:优化实验条件后成功进行了13轮次筛选,随机选取42个阳性克隆测序,各序列GC含量最高达75%,分为6类不同序列;Dotblotting证实这些适体均与BAFF相结合;比较各适体序列结合BAFF的光密度值,以序列44光密度值最高(0.752,P<0.05),具有对BAFF相对最高结合力。结论:首次成功获得特异结合BAFF的高亲和力的单链DNA适体,为研发防治肿瘤和自身免疫疾病新药奠定了基础。

采用Cell-SELEX技术的核酸适配体在肿瘤靶向治疗的研究进展

阐述细胞-配体指数富集系统进化(Cell-SELEX)技术特点,以及通过该技术筛选得到的核酸适配体在肿瘤靶向治疗中的应用进展和挑战,通过查阅近年的相关文献,综述核酸适配体作为药物及药物载体在肿瘤靶向治疗中的应用研究进展。结果表明:基于Cell-SELEX技术筛选得到的核酸适配体在肿瘤靶向治疗中的疗效显著,可开发成为肿瘤靶向治疗的潜力药物及良好的药物载体。

基于外泌体的适配体传感器的构建与应用

基于外泌体的适配体传感器的检测方法具有快速、灵敏、高通量、无创或微创、液体活组织检查和经济高效的分析等诸多优势,成为近年研究热点。综述了目前适配体在检测外泌体、外泌体靶向递送领域的研究进展。首先,介绍了外泌体、适配体和适配体传感器,以及近年常用的适配体筛选技术;其次,阐述基于外泌体的适配体传感器的构建及原理、适配体在外泌体领域的应用;最后,针对目前适配体在外泌体应用领域提出了所遇到的问题和挑战。

一种用于筛选砷(Ⅲ)适配体和检测砷(Ⅲ)的QCM生物传感器

开发了石英晶体微天平(QCM)-指数富集配体系统进化(SELEX)技术,用于筛选出与砷(Ⅲ)有高亲和力的适配体。设计随机单链DNA文库,以砷(Ⅲ)为靶标固定在巯基乙胺修饰的晶振片上,捕获溶液中处于游离状态的适配体,构建QCM-SELEX筛选方法。经过6轮筛选,对次级文库进行高通量测序,通过QCM共振频率变化计算得出6S1解离系数K d值为0.36μmol/L。将6S1作为探针,构建QCM生物传感器用于检测砷(Ⅲ),该传感器在0.01μmol/L~0.2μmol/L范围内有较好的线性关系,对砷(Ⅲ)检测限为5.2 nmol/L(3σ),具有良好的选择性。

核酸适体的筛选及其在养殖动物病原检测中的应用进展

动物疫病的暴发不仅造成了巨大损失,也严重阻碍着人工养殖业的健康可持续发展,因此亟须针对疫病病原开发快速检测技术和病原防控技术来预防病害的暴发。核酸适体(aptamer)是针对特定靶标,利用指数富集配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选得到具有高亲和力和高特异性的功能性单链寡核苷酸。本文结合国内外研究,阐述了核酸适体的优势以及其在人工养殖动物病原微生物防控中的研究进展,同时重点讨论了核酸适体在应用方面的5种挑战,(1)核酸适体筛选技术的局限性;(2)核酸适体在治疗方面缺乏稳定性与安全性;(3)核酸适体在生物体内如何持续性发挥靶向治疗作用;(4)核酸适体在活体实验中的精确性有待提高;(5)核酸适体与其他检测方法能否串联,从而构建全面性的检测平台。目前核酸适体针对养殖动物病原领域的研究只是刚刚起步,在快速检测与靶向治疗方面具有广阔的应用前景。

核酸适体的筛选制备及分析应用

核酸适体(Aptamer)是通过配体指数富集系统进化技术(SELEX)在体外筛选得到的一小段寡核苷酸序列,它可以和不同的靶标,如小分子物质、蛋白质、药物及抗生素等进行高亲和力和高特异性的结合。由于靶分子范围广、相对稳定、易体外合成和修饰等特性,核酸适体在疾病检测、临床治疗、生化分析、药物研发等领域得到了广泛应用。以农药为靶标的核酸适体技术在农药残留检测中也得到了初步应用。总结相关文献,介绍核酸适体的发现、特点及其筛选方法的基本原理和筛选过程中的主要分离方法,列举核酸适体在农药、抗生素、金属离子、生物毒素、微生物以及蛋白质检测中的应用,并对核酸适体的检测应用进行展望。

适配体筛选方法研究进展

利用指数富集配体进化技术(SELEX)可获得与目标靶具有特异性结合能力的适配体(寡核苷酸)。经过近20年的研究,适配体被证实可在科研及临床应用中部分取代抗体,是有很大发展前景的技术领域。适配体技术发展的关键在于对目标靶具有高选择性吸附能力的适配体的筛选和获得。十几年来,以提高筛选效率和效果为目标的适配体筛选技术不断改进,产生了如消减筛选、复合靶筛选、基因组筛选、毛细管筛选等新方法,推动了这一技术的发展。本文对现有适配体筛选方法进行了系统的评述。

核酸适配体技术在食品重金属检测中的应用研究进展

近年来食品中重金属超标对人们健康构成了威胁,所以对食品中重金属检测技术的开发成为了重要研究内容。虽然传统的检测技术对重金属进行了高选择性和高灵敏度的检测,但是仍需要一种简单、快速、有效、成本低廉的方法用于食品安全领域的快速检测。核酸适配体为一段单链DNA或者RNA序列,是经体外筛选技术筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。核酸适配体具有靶分子广、灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点,因而被广泛用于食品安全检测领域。本文综述近年来核酸适配体技术对食品中Hg2+、As3+、Pb2+的检测,并对核酸适体技术在食品重金属检测领域的应用前景进行了展望。

用SELEX技术筛选葡萄球菌肠毒素B特异性适配体

目的通过指数级富集配体的系统进化技术(SELEX)筛选能与葡萄球菌肠毒素B(SEB)特异、高亲和力结合的单链DNA(ssDNA)适配体(aptamer)。方法体外构建一个长度为96个碱基的随机ssDNA文库,与靶物质SEB混合,以磁珠作为固相介质,利用热洗脱方法分离与靶标结合的核苷酸片段,通过PCR反复扩增、富集数个循环。利用荧光素标记适配体,测定筛选过程中各轮结合率;通过地高辛标记适配体,与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体进行酶促显色反应,检测适配体的特异性。结果经过13轮筛选,ssDNA文库与SEB的结合百分率从1.1%提高到39.8%。制备的适配体针对SEB的特异性强,与葡萄球菌A蛋白(SPA)及牛血清清蛋白(BSA)无非特异性结合。结论成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合SEB的高亲和力的ssDNA适配体,为金黄色葡萄球菌感染的诊断与治疗奠定了基础。

细菌的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体（aptamer）是通过指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选的能够以高亲和力和高特异性识别靶标分子或细胞的核糖核酸（RNA）和单链脱氧核糖核酸（ssDNA）。作为化学抗体,核酸适配体的制备和合成比抗体的成本更低。核酸适配体的靶标范围极其广泛,包括小分子、生物大分子、细菌和细胞等。针对细菌靶标筛选的适配体,目前主要应用于食品、医药和环境中的细菌检测。细菌的核酸适配体筛选可以通过离心法将菌体-适配体复合物与游离的适配体分离,并通过荧光成像、荧光光谱分析、流式细胞仪分选、DNA捕获元件、酶联适配体分析等方法表征适配体与靶标的相互作用。筛选出的适配体可结合生物、化学检测方法用于细菌检测。本文介绍了细菌适配体的筛选和表征方法以及基于适配体的检测方法的最新进展,分析了不同检测方法的利弊,并列出了2011~2015年筛选的细菌的核酸适配体。

核酸适体技术在食品安全分析中的应用

核酸适体(Aptamer)是经体外筛选技术(SELEX)筛选出的能特异结合蛋白质或其它小分子物质的寡聚核苷酸片段,对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。经过十几年的发展,SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具,被广泛应用到分子生物学、基因组学、临床医学等领域。高通量筛选的技术特点与Aptamer精确识别、易体外合成与修饰等特性,使得Aptamer在分析化学与生物医药研究方面具有广阔的应用前景。本文对提高筛选效率和效果为目标的核酸适体筛选技术新进展、核酸适体技术在食品安全分析中的应用进行了回顾,展望了核酸适体在食品安全分析上的应用前景。

小分子靶标核酸适配体研究进展

核酸适配体是能够与靶分子高亲和力、高特异性结合的单链寡核苷酸。目前,在生物传感、疾病诊断和治疗等方面,以核酸适配体作为分子识别元件已经开发了许多具有应用可行性的各种检测方法。尽管核酸适配体具有这些方面的应用可能性,但是目前能够结合小分子的核酸适配体非常少。小分子具有多种多样的生物功能以及临床、商业价值,因此针对小分子靶标展开研究,开发新型、实用的分子识别探针用于检测这些小分子具有重要的研究意义。作者主要介绍了针对小分子靶标核酸适配体开发所面临的技术挑战,以及在生物传感和食品安全应用方面所存在的机遇。

肝癌不同靶标核酸适配体的筛选研究进展

早发现、早治疗是改善肝癌患者预后和降低病死率的关键。筛选具有高灵敏度和高特异性的分子识别探针对肝癌的早期诊断、预警、转移和疗效评估等具有重要意义。利用体外指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选获得的核酸适配体,能够高特异性、高亲和力地与多种靶标(包括小分子、蛋白质、细胞、组织、微生物等)结合,为肝癌的特异识别、早期诊断、病理分型提供了有效方法。本研究主要阐述以肝癌细胞系、肝癌血清、临床肝癌组织为靶标的核酸适配体的筛选研究进展。