麝香酮对连二亚硫酸钠造成PC12细胞缺氧损伤的保护作用

目的:研究麝香酮对PC12细胞缺氧损伤的影响。方法:在离体培养的PC12细胞用连二亚硫酸钠造成缺氧损伤模型,通过细胞形态学观察、MTT微量比色、培养介质LDH活力测定,研究了麝香酮对该模型的保护作用。结果:5×10-7～510-51mol/L范围内,麝香酮浓度依赖性地降低连二亚硫酸钠造成缺氧损伤模型所致培养介质内LDH的释放,其IC50为43.91μmol/L。在10-7～5×10-4mol/L范围内,麝香酮浓度依赖性地增加连二亚硫酸钠造成缺氧损伤模型培养介质MTT比色值。其IC50为28.31μmol/L。结论:麝香酮对连二亚硫酸钠造成PC12细胞缺氧损伤具有保护作用。

缺氧复氧联合连二硫酸钠损伤制备心气虚细胞模型

目的:探讨心气虚细胞模型的制备方法。方法:体外培养心肌细胞,分成正常培养组、缺氧3h、4h复氧2h模型组和药物组及分别加入1mmol/L Na2S2O4、2mmol/L Na2S2O4、3mmol/L Na2S2O4+缺氧3h、4h复氧2h模型组和药物组。MTT法检测含药血清对细胞的毒性。以检测培养上清心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)为指标。结果:单纯缺氧/复氧以及连二硫酸钠合并缺氧/复氧均可造成心肌细胞损伤,随着缺氧时间的延长和连二硫酸钠浓度的增加,对心肌细胞的破坏程度不断加重。加入益气活血方药物血清干预后,对心肌细胞有一定的保护作用。结论:根据实验结果,选择1mmol/L Na2S2O4合并缺氧无糖4h复氧2h做为心气虚细胞模型的造模条件较好。

神经细胞缺氧/复氧体外模型的研究进展

缺血性脑卒中是世界人口第二大死亡原因和第三大致残原因,发病率在全球范围内逐年增加。缺血性脑卒中经过血液再通治疗后会引起缺血/再灌注损伤,而缺血/再灌注损伤的机制目前仍不是十分明确,因此,构建具有其特性的临床前模型十分必要。鉴于动物模型研究的复杂性和体外脑切片培养的局限性,体外细胞模型成为了简化而有价值的工具。该文对目前常用的神经细胞以及缺血/再灌注体外模型的构建方法、构建原理及相关研究进展进行阐述,以期为合理选择缺氧/复氧细胞模型进行脑缺血/再灌注的基础研究与药物筛选提供参考和依据。

氧耗剂致乳鼠心肌缺氧/复氧模型的建立

目的探讨利用氧耗剂建立乳鼠心肌缺氧/复氧损伤模型的一种新方法。方法取SD乳鼠原代心肌细胞培养,观察氧耗剂连二亚硫酸钠不同浓度(1,2,3,4,5,6mmol/L)分别缺糖缺氧1h复氧24h及在4mmol/L浓度下缺糖缺氧不同时间(5min,15min,30min,1h,2h,4h,6h)后复氧24h对心肌细胞存活率及培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的影响,并进行细胞形态学观察。结果乳鼠心肌细胞经过缺氧/复氧处理后,与正常对照组相比,连二亚硫酸钠可呈浓度依赖性降低心肌细胞存活率,尤其Na2S2O4浓度大于3mmol/L时细胞MTT的OD值与正常对照组有显著性差异,同时上清液中LDH含量升高,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。而当连二亚硫酸钠4mmol/L浓度下随着缺氧时间延长,细胞的存活率显著降低,而心肌细胞上清液中LDH的释放量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),呈现时间依赖性。结论应用连二亚硫酸钠可建立心肌细胞缺氧再灌注损伤模型。

人近曲肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的建立

目的建立一种新的人近曲肾小管上皮细胞HK2缺氧/复氧损伤模型。方法本实验使用人近曲HK2。实验分为缺氧4、12和24h及缺氧24h后复氧4、12和24h组,每个实验组均设立空白对照组。采用经高温灭菌的液体石蜡覆盖法造成缺氧环境;苔盼兰摄取法进行细胞计数及检测细胞存活率,生化法检测培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果人肾小管上皮细胞经过缺氧/复氧处理后,苔盼兰摄取率显著提高,细胞存活率显著下降,LDH含量升高。说明缺血再灌注损伤导致了细胞膜的完整性破坏,甚至细胞发生了不可逆转的损伤。结论采用液体石蜡覆盖法建立人近曲肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型,较其他制模方法操作简单、易行、可靠。

安宁包缺氧体系用于构建乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的研究

目的采用安宁包缺氧体系构建SD乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,评估其实验条件,为开展心肌缺血/再灌注损伤的分子机制研究奠定基础。方法采用安宁包缺氧体系分别处理SD乳鼠原代心肌细胞指定时间(3 h、4 h、6 h、12 h),再进行复氧24 h,并采用AnnexinV/PI双染-流式细胞术检测细胞凋亡率与坏死率。结果与正常组相比,安宁包缺氧体系处理6 h、12 h分别诱导心肌细胞坏死率上升29.82%和44.19%,差异具有统计学意义(P<0.01);与正常组相比,安宁包缺氧体系处理4 h后复氧24 h诱导心肌细胞凋亡率上升35.8%,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论采用安宁包缺氧体系处理SD乳鼠原代心肌细胞4 h后复氧24 h为较合适的缺氧/复氧损伤模型实验条件。

细胞缺氧复氧模型建立方法的研究进展

细胞缺氧复氧模型被广泛的用于机体缺血/再灌注损伤及缺血预适应的研究,本文综述了细胞缺氧复氧模型建立方法的最新研究进展,包括单纯物理性模型、单纯化学性模型,以及对模型的评价。

心肌细胞缺氧/复氧模型的构建及研究进展

心肌细胞缺氧/复氧模型是模拟心肌缺血再灌注损伤及相关疾病的经典细胞模型,具有操作便捷、直观形象、稳定性好等优势,可准确反映疾病细胞水平的病理改变,广泛应用于药物与疾病的分子机制研究。缺氧/复氧是导致多种心血管疾病的主要机制之一,构建理想的心肌细胞缺氧/复氧模型是深入研究心血管疾病机制的基础,目前该模型的构建方法较多,主要包括物理法(混合气体培养法、厌氧袋/罐法、液体石蜡封闭法)、化学法(氧耗法、超氧法、酶抑法和缺氧液法)和联合法等,其中混合气体培养法和氧耗法最常用。

大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的建立

目的探讨建立大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧/复氧损伤模型的一种新方法。方法本实验使用大鼠NRK-52E细胞。实验分为对照组和实验组,实验组分为缺氧2,4,6h及缺氧后复氧1,12和24h组。缺氧时换用缺氧液,再置入N294%+O21%+CO25%缺氧环境;缺氧后换用含10%胎牛血清的EMDM/F12,置入95%空气+CO25%有氧环境,制作缺氧/复氧模型;台盼蓝摄取法进行细胞计数及检测细胞存活率,分光光度法检测培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果大鼠肾小管上皮细胞经过缺氧/复氧处理后,与对照组相比,台盼蓝摄取率显著提高,细胞存活率显著下降,LDH含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用三气孵箱法建立大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型,较其他制模方法操作简单、易行、可靠。

厌氧培养箱法建立大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型

目的探讨建立大鼠心肌细胞H9c2缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤模型的一种新方法。方法实验使用大鼠心肌细胞H9c2,随机分为对照组和实验组,对照组常规培养不做处理,实验组分为缺氧2、4、8、12 h及缺氧后复氧2 h组。缺氧时换不含血清的低糖DMEM培养基,再置入85%N2、10%H2、5%CO2缺氧环境。缺氧后,加入新鲜DMEM培养基,置入二氧化碳培养箱中继续培养2 h。苔盼蓝染色检测细胞存活率,Annexin V/PI染色行流式细胞术检测细胞凋亡率,分光光度法检测培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果大鼠心肌细胞经过H/R处理后,与对照组比,细胞存活率显著下降,LDH含量升高,细胞凋亡率显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用厌氧培养箱法建立大鼠心肌细胞H/R损伤模型简单易行,重复性好。

液体石蜡封闭法建立大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型

目的:探讨液体石蜡封闭法建立大鼠心肌细胞H9C2缺氧/复氧损伤模型的可行性与稳定性。方法:将体外培养在六孔板中的大鼠心肌细胞H9C2随机分为对照组和实验组,对照组常规培养不做处理,实验组每孔细胞用高温灭菌的液体石蜡2mL封闭,造成缺氧环境,缺氧时间段分别为2、4、8、12h,处理结束后吸除石蜡,加入新鲜DMEM培养基,置二氧化碳培养箱中继续培养2h。超氧阴离子探针Dihydroethidium检测活性氧自由基含量变化;AnexinV/PI染色行流式细胞术检测不同时间缺氧/复氧处理后细胞凋亡率。结果:对照组细胞产生少量氧自由基;实验组随缺氧/复氧时间延长,氧自由基含量逐渐增加,缺氧2、4、8、12h细胞凋亡率分别为(0.76±0.15)%,(5.22±0.74)%,(10.36±2.07)%,(31.00±4.32)%,与对照组相比除缺氧2h组外其余三组均有显著性差异(P<0.05)。结论:液体石蜡封闭法建立H9C2缺氧/复氧损伤模型简单易行、重复性好。

巨噬细胞缺氧复氧模型的制作方法及其生物学意义

目的:建立一种简单可行的巨噬细胞缺氧复氧(H/R)模型。方法:采用制备缺氧液与氮气饱和相结合的方法制造细胞缺氧环境。巨噬细胞系RAW264.7分为对照组、缺氧(30、60和120min)复氧(15或30min)组及H/R+不同剂量的依达拉奉(EDA)组,借助于倒置荧光显微镜及流式细胞仪观测巨噬细胞内活性氧(ROS)浓度的变化,作为评判H/R模型成功与否的标准。结果:与各自对照组比,缺氧60min复氧15 min组即可引起ROS浓度明显升高(P<0.05),随着H/R时间延长,ROS生成呈进行性增加趋势。ROS清除剂EDA能剂量-依赖地抑制H/R所致ROS的大量生成。结论:应用制备缺氧液与氮气饱和相结合的方法可成功建立巨噬细胞H/R模型,该模型适于不同脏器缺血再灌注损伤共同分子机制的探讨及寻找共同治疗策略的相关研究。

快速建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的方法

目的探索一种快速建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的方法。方法取新生1d^3d SD乳鼠,原代心肌细胞培养,观察连二亚硫酸钠(Na_2S_2O_4)不同浓度(1,2,4mmol/L)分别缺氧1h/复氧24h及在4mmol/LNa_2S_2O_4的终浓度下,缺氧30min,观察不同复氧时间(1h,2h,3h,4h,5h,6h),利用MTT法检测心肌细胞存活率及化学比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)的释放,并进行细胞形态学观察。结果乳鼠心肌细胞给予不同浓度Na_2S_2O_4进行缺氧1h/复氧24h处理后,发现Na_2S_2O_4浓度为4mmol/L时,MTT的OD值与正常对照组相比有显著性差异,同时上清液中LDH含量升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。在Na_2S_2O_4终浓度为4mmol/L的基础上,给予缺氧30min,复氧1h^6h,心肌细胞存活率显著降低,上清液中LDH释放显著增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论使用Na_2S_2O_4建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型方便、快捷、高效。

基于pgrmc1调控的黄体酮抑制氧糖剥夺/复氧新生小鼠神经元损伤机制分析

目的 基于黄体酮膜受体组件1(pgrmc1)调控,探讨黄体酮抑制氧糖剥夺/复氧(OGD/R)新生小鼠神经元损伤的作用机制。方法 选用出生12 h内的新生小鼠分离原代皮层神经元细胞,体外培养7 d,利用微管相关蛋白2检测进行鉴定后,随机分为对照组、二甲基亚砜(DMSO)组、AG205组、黄体酮组、AG205+黄体酮组。DMSO组、AG205组、黄体酮组、AG205+黄体酮组加入制备好的缺糖D-Hanks液、置于缺氧培养箱中培养2 h,换为神经元生长培养基;DMSO组在造模前1 h给予DMSO预处理,AG205组和AG205+黄体酮组在造模前1 h给予AG205(pgrmc1拮抗剂)10μmol/L预处理,黄体酮组和AG205+黄体酮组于造模后2 h给予黄体酮20μmol/L。复氧24 h后,采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测凋亡细胞。结果 DMSO组、AG205组细胞存活率低于对照组,AG205组低于DMSO组;黄体酮组、AG205+黄体酮组细胞存活率高于AG205组,黄体酮组高于AG205+黄体酮组(P均<0.05)。DMSO组、AG205组细胞凋亡率高于对照组,AG205组高于DMSO组,黄体酮组、AG205+黄体酮组细胞凋亡率低于AG205组(P均<0.05)。结论 黄体酮可抑制OGD/R新生小鼠神经元损伤,抑制pgrmc1可降低OGD/R神经元活力、增加细胞凋亡,黄体酮抑制OGD/R神经元损伤的作用可能与调控pgrmc1有关。

细胞缺氧/复氧模型的建立方法与应用

本文介绍了缺氧/复氧模型建立的基本方法并简述了几种常用建模细胞的缺氧特性。参阅国内外学者建模的研究,分析了缺氧复氧模型优劣与适用选择原则。据此为实验室选择建模方法提出更多参考思路。

人血管内皮细胞缺氧复氧损伤细胞模型的建立

目的:构建人血管内皮细胞缺氧复氧细胞模型,作为组织瓣缺血再灌注损伤的体外研究模型。方法:原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养扩增至第5代。依据缺氧时间随机分为4组:正常对照组(Control组),3h/2h组、6h/2h组、9h/2h组;Control组以完全培养基正常培养,实验组分别以低糖无血清培养基于缺氧环境下培养3、6、9 h,后换用原完全培养基复氧培养2 h。显微镜下大体观察各组细胞形态、结构、数目,台盼蓝实验测定存活细胞比例,CCK-8法测定细胞活性,Annexin V-PI染色流式细胞仪测定细胞凋亡比例。采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与对照组相比,镜下可见实验组细胞损伤程度明显较高;随缺氧时间延长,损伤加重,细胞密度减低。台盼蓝实验及CCK-8实验结果显示,实验组存活细胞比例及细胞活性较对照组显著降低,且随缺氧时间增加而显著下降(P<0.05)。细胞凋亡实验表明,随缺氧时间增加,细胞早期凋亡、晚期凋亡比例均显著上升(P<0.05),细胞凋亡水平加重。结论:建立了稳定可靠的人血管内皮细胞缺氧/复氧损伤细胞模型,为组织瓣缺血再灌注损伤的体外实验研究提供了基础。

基于混合气体法的H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型建立及优化研究

目的比较移动式三气培养箱和厌氧产气袋密闭培养盒2种混合气体法建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型的优缺点,并进一步对培养条件进行优化。方法将处于对数生长期的H9c2心肌细胞分别置于移动式三气培养箱(94%N2、5%CO2、1%O2)和厌氧产气袋密闭培养盒(21%CO2、5%O2)中,分别缺氧不同时间(2、4、6、8、10 h),再进行复氧(95%O2、5%CO2)4 h。采用MTS法检测心肌细胞存活率,比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性。采用L(934)正交试验进一步对细胞缺氧时间(6、8、10 h)和细胞培养液条件(血清比例、血糖含量)进行优化,最终确定模型建立的最佳缺氧时间和培养条件。结果 2种造模方法均能使心肌细胞存活率下降,乳酸脱氢酶活性升高。但采用移动式三气培养箱造模的心肌细胞存活率在缺氧4 h后能稳步快速下降(6、8、10 h,与正常对照组比较,P<0.01),LDH活性随着缺氧时间的延长明显增高(6、8、10 h,与正常对照组比较,P<0.01),且该模型重复性较好,稳定可控。而厌氧产气袋模型组的细胞存活率及LDH活性均不随时间规律性变化,较难在短时间内建立稳定、可靠的模型。正交试验结果以缺氧6 h、无糖、无血清作为优化培养条件。结论选择移动式三气培养箱法建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型用时短、操作简便,结果相对稳定,将培养液更换为无血清、无糖培养液可加快模型的建立。

利用低氧/厌氧工作站建立H9c2细胞缺氧复氧模型的探讨

目的利用低氧/厌氧工作站,结合不同的缺氧条件,探讨建立H9c2细胞缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型的最佳方法。方法缺氧时将H9c2细胞置于低氧/厌氧工作站中,分别以完全培养基,无糖培养基和酸性缺氧液培养1、2、4、6、8 h,缺氧后换用完全培养基于培养箱中按常规条件培养1 h。流式细胞仪测定细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞生存率,倒置显微镜下观察H9c2细胞形态变化。结果与对照组比较,缺氧时以完全培养基和无糖培养基处理的H9c2细胞H/R后,细胞内ROS含量和细胞存活率随缺氧时间延长无明显改变,且倒置显微镜下未观察到明显的形态变化。缺氧时以酸性缺氧液处理的H9c2细胞,随H/R时程的延长,细胞内ROS含量不断增加(P<0.01),且细胞存活率逐渐降低(P<0.01),倒置显微镜下观察到细胞H∶1 h/R∶1 h后开始出现部分细胞皱缩,少量坏死细胞漂浮,随时间延长损伤加重;缺氧8 h后,细胞皱缩成圆形,大量坏死细胞漂浮,复氧1 h后可见细胞膜表面不平滑,复氧液中仍有少量坏死细胞漂浮。结论采用低氧/厌氧工作站,并结合酸性缺氧液,可成功建立重现性非常好的H9c2细胞H/R模型。

建立新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型

目的：探讨缺氧密闭法建立新生SD大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型的可行性与稳定性。方法：将体外培养的新生SD大鼠心肌细胞随机分为对照组（不做处理）和实验组（进行不同时间（30min、1-4h）的缺氧／复氧处理）。DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）浓度；AO／EB双染法及AnexinV／PI流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：对照组ROS浓度及细胞凋亡率均较低；而实验组随着缺氧时间的延长，ROS浓度逐渐增加，细胞凋亡数逐渐增多。不同缺氧时间段细胞凋亡率与对照组比，除缺氧30min组外，1-4h组差异均有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01）。结论：厌氧产气袋．缺氧密闭系统建立新生SD大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型稳定、可行且重复性好。