连接介导PCR及其在体内足迹研究中的应用

连接介导聚合酶链反应是以连接反应为基础的单侧PCR技术 ,首先在DNA片段的一端连接上一个公共连接子 ,而后在这个连接子与另一个DNA序列特异的引物间扩增 .Vent聚合酶的使用 ,延伸产物捕获及连接子标记选择策略的采用 ,大大提高了连接介导聚合酶链反应的敏感性 .

应用连接介导PCR法于线粒体DNA的测序

目的 简化DNA测序方法 ,优化条件 ,以适用于线粒体DNA的测序。方法 应用MaxamGilbert化学断裂反应和连接介导PCR(LigationMediatedPCR ,LMPCR)来测定线粒体DNA的序列。结果 读取的 14 0bp的核苷酸序列 ,输入基因库 ,确定为线粒体DNA重链 80 51～ 8190片段的序列 ,符合率为 70 7% ( 99/14 0 )。结论 该方法改进的成功 ,对进一步进行线粒体DNA氧化损伤图谱分析等研究 。

A+G连接介导PCR方法的建立及其在体内足迹研究中的应用

目的建立一种新的连接介导聚合酶链反应（ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄｐｏｌｙ－ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＬＭ－ＰＣＲ）方法，使之能够对Ｇ－残基含量过低或不含Ｇ－残基的区域进行体内足迹研究。方法对原化学测序法中的Ａ＞Ｇ法进行修改，化学裂解后进行连接介导的ＰＣＲ反应，通过测序胶分离分析ＰＣＲ反应结果。结果建立了Ａ＋ＧＬＭ－ＰＣＲ方法，本法能够应用于体内足迹研究。结论应用本实验建立的方法可分析Ａ－残基和Ｇ－残基上的蛋白质－ＤＮＡ相互作用状况，可获得更多信息及扩大使用范围。

检测人TCR BD基因重排时RSS断裂末端的LM-PCR方法的建立

目的:建立检测人T细胞TCRBD基因(Diversity Gene)经历重排的连接介导PCR方法(Ligation Mediate dPCR,LMPCR),为T细胞重排和疾病的关系研究提供基础。方法:在人TCRβ链BD1与BD25′端重组信号序列(RSS)前,BD1与BD23′端RSS后各设计两套用于巢式PCR引物;设计并合成和双链RSS平断裂末端相接的特殊接头(BWLinker),提取胸腺组织、正常人和急性T淋巴细胞白血病(TALL)外周血单个核细胞(PBMC)样本总DNA,和BWlinker连接,进行巢式PCR,PCR产物琼脂糖电泳分析,阳性产物做胶回收,并克隆测序鉴定。结果:在1例胸腺组织提取的总DNA中证实存在BD1和BD25′和3′的RSS断裂末端,在2例TALLs的PBMC中检测到BD25′和3′的RSS断裂末端,2例正常人PBMC中未能检测到RSS断裂末端,阳性的LMPCR产物通过测序鉴定,和基因组中序列完全相符合。结论:1例胸腺组织和2例TALL的PBMC中检测到RSS断裂末端,提示TCRBD基因正经历重排,测序结果表明建立的监测TCR重排的LMPCR方法可靠,可用于T细胞重排模型和相关疾病的机制研究。

2种PCR方法扩增盐藻肌动蛋白基因3’旁侧序列比较

目的 :比较扩增盐藻肌动蛋白基因 3’旁侧序列的 2种PCR方法。方法 :用pvuⅡ、EcoRⅤ和StuⅠ 3种限制性内切酶消化盐藻基因组DNA后 ,供 2种PCR用 ,一种是连接介导法PCR(LMPCR) ,与用人工合成的适配子相连并用适配子引物和盐藻肌动蛋白基因特异引物扩增未知序列 ;另一种是反向PCR(IPCR) ,酶切后的DNA自身环化做模板 ,用 2对基因特异引物反向扩增。结果 :2轮PCR后 ,LMPCR中得到大量的非特异扩增产物 ,测序结果发现许多产物是由适配子引物AP2单独扩增引起。而反向PCR在得到pvuⅡ和StuⅠ消化的自连文库中扩增得到 2 .5kb特异产物 ,经测序发现 ,片段两侧为基因特异引物 ,部分序列与已知序列相一致。Southern也进一步证实了IPCR扩增片段来源于盐藻基因组DNA。结论 :IPCR技术在克隆基因旁侧序列时优于LMPCR方法。

棉花E3泛素连接酶基因GhRING1-like的克隆及功能分析

[目的]RING(really interesting new gene) finger E3泛素连接酶在植物生长发育和抵御环境胁迫中具有重要作用。克隆棉花RING finger E3泛素连接酶基因GhRING1-like并分析其表达特征和功能,为该基因分子作用机制研究和育种应用奠定基础。[方法]根据棉花表达谱分析,选取并克隆干旱胁迫处理上调表达基因GhRING1-like,qRT-PCR分析GhRING1-like的组织表达特性及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式;采用瞬时表达对GhRING1-like-GFP融合蛋白进行亚细胞定位分析;通过获得病毒介导的基因沉默(VIGS)棉花和过表达拟南芥植株,分析沉默或过表达GhRING1-like对植株生长发育及其抗旱性的影响。[结果]GhRING1-like基因序列全长996 bp,编码332个氨基酸,其C端含有RING-H_2(C3H_2C3)结构域。GhRING1-like定位于内质网上。GhRING1-like在叶片中优势表达; 200 g·L^(-1)PEG6000诱导处理1 h后瞬时显著上调表达12倍; GhRING1-like对Na Cl、ABA和SA的响应时间都在处理后3 h,上调表达均在5倍左右。干旱胁迫处理后,VIGS沉默GhRING1-like棉花叶片相对含水量和叶绿素荧光参数Fv/Fm分别较未沉默对照降低17.1%和30.6%,而电解质渗透率和丙二醛含量分别较对照提高70.8%和100%。过表达GhRING1-like显著提高了拟南芥种子萌发和幼苗期对于甘露醇引起的渗透胁迫的耐受性;可使营养生长中后期阶段的拟南芥在水分亏缺处理下的存活率提高2.4倍;转基因拟南芥叶片气孔开度降低51.2%,失水率明显降低。干旱胁迫下,过表达GhRING1-like使依赖于ABA诱导表达的At AREB1、At ERD15、AtRD29A上调表达,而对不依赖ABA的干旱胁迫诱导基因At DREB和脯氨酸合成基因At PLD没有影响。[结论]棉花GhRING1-like参与了植物非生物胁迫抗性的调控,主要通过依赖于ABA通路正向调控植物的抗旱反应。

连接介导PCR分析线粒体DNA的氧化损伤频率及损伤热点

目的 论证线粒体DNA(mitochondrial,mtDNA)“常见缺失”与DNA氧化损伤的关系。方法 采用连接介导PCR(ligationmediatedPCR ,LMPCR) ,在大鼠肝细胞株 (BRL 3A)暴露于 5 0mmol/L过氧化氢 (H2 O2 )形成氧化损伤后 ,分析该缺失的断裂区段 (80 71～ 8190 ,约 12 0bp)内 ,各核苷酸氧化损伤的频率及热点。结果 在 80 71～ 8190区段 ,存在 8181G、8182G两个明显的氧化损伤热点 ,810 8C及80 96～ 810 1(6bp)的损伤亦明显 ;而“常见缺失”的断裂位点 (8118T)并未被明显氧化损伤。其中 ,8181G/ 8182G位于一个DNA重复结构内 ,80 96～ 810 1(6bp)则位于一个DNA回文结构内。结论 线粒体DNA“常见缺失”的断裂位点不一定是氧化损伤的热点 ,但在断裂区段内存在

侧翼序列克隆方法评价

克隆已知序列的侧翼DNA区域是基因操作实验中经常面临的任务之一。自PCR技术发明以来,以其为基础克隆侧翼序列的方法不断开发,如反向PCR(inversePCR)、捕捉PCR(capturePCR)、VectorettePCR、抑制PCR(suppressionPCR)、T接头PCR(T-linkerPCR)、多功能接头PCR(versatilecassettePCR)、AluPCR、热不对称交错PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR)和DNA步行—复性控制引物(DNAwalking-an-nealingcontrolprimerTM)等。本文对上述方法的原理进行了简要的概括和总结,据此将其归为三大策略,即连接成环PCR、外源接头介导PCR和半随机引物PCR。对不同的策略和同一策略中不同的方法的优缺点亦进行了比较,进而讨论和展望了它们的主要应用领域和潜力,以期对实际操作起到借鉴作用。

HTLV-1病毒相关HAM/TSP的发病机制研究

目的:研究HTLV-1病毒通过血脑屏障(BBB)的方式,提示HTLV-1侵犯中枢神经系统(CNS)的机制,从而提示人嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型相关性脊髓病/热带痉挛性截瘫(HAM/TSP)病发病机制和感染途径。方法:通过连接介导多聚酶链反应(LMPCR)分别扩增出5例HAM/TSP患者脑脊液和外周血淋巴细胞中的HTLV-1前病毒DNA片段的序列,然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测序列的扩增情况,并比较HTLV-1前病毒在脑脊液和外周血淋巴细胞中整合序列的相同机率。结果:HAM/TSP患者脑脊液中存在HTLV-1感染的淋巴细胞数多克隆增殖,而且在脑脊液与外周血中存在HTLV-1病毒整合位点的淋巴细胞克隆。结论:HTLV-1感染可能是通过细胞与细胞间作用而通过血脑屏障的,尤其是通过HTLV-1感染的淋巴细胞迁移至CNS,继而进行增殖并激活CNS中的其它T淋巴细胞,通过对CNS细胞特异性免疫反应和释放细胞因子导致HAM/TSP的病理改变。

Egfr基因启动子区的DNaseⅠ高敏感位点定位

目的用一种新方法研究表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因启动子区脱氧核糖核酸酶Ⅰ高敏感位点(DNaseⅠhypersensitive site,DHS),找出确切DNaseⅠ酶切位点,进而预测可能与DHS相结合的转录因子,探索egfr基因表达调控机制。方法本研究以宫颈癌细胞系HeLa(EGFR+)、乳腺癌细胞系MDA-MB-231(EGFR+)和阴性对照白血病细胞系K562(EGFR-)为模型,在用浓度为5kU/L、10kU/L DNaseⅠ消化细胞核中染色质后,采用连接介导PCR(ligation-mediatedPCR,LM-PCR)的方法,检测出egfr基因启动子区DHS,并进行测序。通过对测序结果进行分析,确定egfr基因启动子区DHS的具体位置。用生物信息学方法对所得DHS进行分析,预测与之结合的转录因子。结果对测序结果进行分析得到确切DNaseⅠ酶切位点。在egfr基因表达阳性的宫颈癌细胞系HeLa、乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,DHS位于转录起始点上游300bp至500bp的启动子区内;而在egfr基因表达阴性的白血病细胞系K562中未发现DHS。运用生物信息学方法,用转录元件搜索软件(transcription element search software,TESS)对DHS进行分析,找到16个可能与egfr基因启动子区DHS序列相结合的转录因子。结论在egfr基因表达阳性的细胞系中,egfr基因启动子区存在DHS,可能是转录因子的结合区。这些实验结果为研究egfr基因启动子区空间构象、预测转录因子结合位点提供了部分实验依据。

慢病毒载体在人角质形成细胞基因组中的整合位点分析

目的检测慢病毒载体(lentiviral vector)在人角质形成细胞基因组中的整合位点,初步分析慢病毒载体在表皮细胞基因组中的整合位点分布规律。方法以本课题组前期研究中构建的慢病毒载体感染的人永生化角质形成细胞系为研究对象,应用连接介导PCR(ligation-mediated PCR,LM-PCR)技术克隆慢病毒载体在其基因组中的整合位点序列,测序克隆片段后经在线工具GTSG-QuickMap在人类基因组上定位,从而得到整合位点。再从整合位点分布与染色体、基因及其转录起始位点的关系来分析慢病毒载体在人角质形成细胞基因组中的整合倾向性。结果对1 148个阳性转化子DNA测序及定位分析,共得到199个整合位点。与GTSG-QuickMap模拟的随机对照相比,慢病毒载体的整合频率在第4、5、15、16号染色体上、基因转录起始位点上游5 kb至50 kb范围内显示出统计学显著性差异。结论慢病毒载体倾向于整合在人角质形成细胞基因组中的基因转录起始位点附近区域,而并不倾向于整合在基因内部的整合模式。

外源基因插入位点旁侧序列的研究方法及进展

外源基因插入位点的研究,是转基因植株分子检测的一项重要内容。本文综述了近些年用于旁侧序列测定的染色体步移技术及其发展,介绍了基于基因组文库和PCR的染色体步移技术。同时总结了基因组文库步移、反向PCR、锅饼PCR、T-linker PCR和TAIL-PCR的原理及其特点,以期在实验方法的选择上提供参考意见。

LPA法克隆嗜盐菌Halobacterium species xz515古紫质基因(英文)

Halobacteriumspeciesxz515是从中国西藏分离到的嗜盐菌,所含古紫质(古细菌视紫红质的简称命名为AR4)具有与其他已知菌视紫红质相反的质子释放和吸收的顺序而引起重视.连接反应介导的PCR扩增法(LPA)是一种克隆部分序列已知的基因的新型克隆方法.LPA法利用"酶切-连接-PCR"之组合,首先选定一组限制性内切酶,各自单独地酶切细菌总DNA样品,然后酶切产物分别与相应的寡聚核苷酸片段接头连接.连接液混合起来,作为扩增未知序列DNA的模板.通过这种方法,克隆到了包括完整AR4基因开放阅读框和0.4kb上游调控区域的总长度1.3kb的DNA片段.实验结果表明LPA法可以代替传统的构建基因组DNA文库的方法,可以快速有效地获得目标基因相关的序列.