Wnt3a转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞及对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响

背景:Wnt信号通路是动物胚胎发育过程中重要的调控通路,建立Wnt信号通路细胞模型对于研究该通路有重要意义。目的:以Wnt3a真核表达质粒转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞,构建能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型,观察经典Wnt信号通路对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响。方法:将扩增真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0进行酶切鉴定。应用脂质体转染技术将真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0和对照质粒pgk-neo-pcDNA3.0转染入胸腺激酶缺陷细胞,经过G418筛选后挑出细胞克隆,扩大培养。应用RT-PCR技术检测表达产物,应用间接免疫荧光技术检测Wnt3a对鼠胸腺激酶缺陷细胞β-catenin亚细胞分布的影响。结果与结论:Wnt3a质粒经过酶切鉴定证明所扩增的质粒为目的质粒。经过G418筛选3周后,挑选10个稳定转染的细胞克隆,进行RT-PCR检测,可见在L-Wnt3a细胞的cDNA产生1条长度为320bp亮带,表明扩增产物为所需要的目的片段,Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后有Wnt3a在mRNA转录水平表达。转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞cDNA未扩增出目的条带。免疫荧光检测可见Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后细胞浆中有Wnt3a蛋白表达,转染对照质粒组无表达。Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞核中可见明亮的红色荧光,提示β-连环素蛋白在胸腺激酶缺陷细胞-Wnt3a细胞聚集并进入细胞核中。转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞浆未见有明显β-连环素蛋白着色,细胞核中无β-连环素蛋白的聚集。构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型,真核表达Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞能够获得稳定表达,促进胸腺激酶缺陷细胞浆中β-连环素蛋白向细胞核转移。

β-连环素蛋白预测分化型甲状腺癌转移的价值

目的探讨β-连环素蛋白预测分化型甲状腺癌转移的临床价值。方法选取2013年2月至2019年10月华中科技大学协和深圳医院收治的423例分化型甲状腺癌患者,其中男123例,女300例;组织学类型:乳头状癌297例,滤泡癌126例;TNM分期:Ⅰ~Ⅱ期232例,Ⅲ~Ⅳ期191例,根据术后组织病理结果,将患者分为转移组(73例)和未转移组(350例)。免疫组化法检测癌组织中β-连环素蛋白表达情况,比较两组患者的临床病理参数及β-连环素蛋白评分,应用ROC曲线分析β-连环素蛋白评分预测分化型甲状腺癌转移的临床价值,应用多因素Logistic回归分析分化型甲状腺癌转移的影响因素。结果β-连环素蛋白在癌组织中主要表达于细胞膜上。转移组的β-连环素蛋白半定量评分明显高于未转移组[(6.61±1.82)分vs.(3.60±1.11)分],差异有统计学意义(t=13.612,P<0.001);且两组患者的年龄、肿瘤直径、病灶位置及TNM分期等差异有统计学意义(P<0.05)。β-连环素蛋白表达与肿瘤直径、TNM分期及腺外侵犯相关(P<0.05),与性别、年龄、组织学类型及病灶位置等无关(P>0.05)。根据ROC曲线,β-连环素蛋白评分诊断分化型甲状腺癌转移的最佳临界值为4.08分,敏感度为65.75%,特异度为69.43%,ROC曲线下面积(AUC)为0.708(95%CI:0.645~0.772),具有一定的预测价值。Logistic回归分析结果显示,β-连环素蛋白评分>4.08分(OR=1.824,95%CI:1.315~2.530)、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期(OR=1.735,95%CI:1.105~2.723)及肿瘤直径>1.0 cm(OR=1.523,95%CI:1.207~1.924)是分化型甲状腺癌转移的独立危险因素(P<0.05)。结论β-连环素蛋白在分化型甲状腺癌中异常表达,对预测甲状腺癌转移有一定的临床价值。

E-钙黏附蛋白和p120-连环素蛋白在乳腺浸润性小叶癌和导管癌中的表达差异及意义

目的比较乳腺浸润性小叶癌（ILC）和浸润性导管癌（IDC）的临床病理学特征，探讨E-钙黏附蛋白（E—cadherin）和p120-连环素蛋白（p120-catenin）在ILC和IDC中的表达差异及意义。方法中国医学科学院肿瘤医院1999年1月至2006年12月共收治ILC123例，2000年收治IDC334例。运用组织微阵列及免疫组织化学染色技术，对123例ILC和334例IDC患者的组织蜡块进行切片，并进行E—cadherin和p120-catenin表达的检测，同时对患者进行随访。结果ILC和IDC患者的5年无瘤生存率（DFS）分别为61．8％和83．7％（P〈0．001），5年总生存率（OS）分别为81．7％和79．1％（P=0．055）。在36例ILC和221例IDC患者中，E—cadherin表达缺失率分别为55．6％（20／36）和20．4％（45／221，P〈0．001），p120-catenin胞浆表达率分别为66．7％（24／36）和16．3％（36／221，P〈0．001）。在ILC患者中，p120-catenin胞浆表达与E—cadherin表达缺失相关（P：0．002）。ILC和IDC患者中，p120-catenin胞浆表达合并E—cadherin表达缺失的比率分别为55．6％（20／36）和4．1％（9／221，P〈0．001）。结论ILC具有不同于1DC的临床病理学特点及预后特征，E-cadherin和p120-catenin的检测有助于ILC和IDC的鉴别诊断。

β-连环素蛋白与神经细胞黏附分子在甲状腺癌中的表达及相关性分析

目的探究β-连环素蛋白(β-ceatenin)与神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule ,NCAM)在甲状腺癌的表达及两者的相关性。方法选取2012年12月至2017年12月浙江中医药大学附属温州中西医结合医院普外科收治的62例甲状腺癌组织及同期行手术切除的44例甲状腺腺瘤组织,采用免疫组化染色法检测NCAM及β-catenin在甲状腺癌组织和甲状腺腺瘤组织的表达水平,并分析NCAM及β-catenin的表达水平与甲状腺癌患者临床病理特征的关系及两者的相关性。结果NCAM在甲状腺癌组织的阳性表达率(12.90%)明显低于甲状腺腺瘤组织(90.91%),差异具有统计学意义(t=63.203 ,P=0.000);β-catenin蛋白在甲状腺癌组织的阳性表达率(82.26%)明显高于甲状腺腺瘤组织(6.82%),差异具有统计学意义(t=58.608,P=0.000);NCAM与β-catenin在甲状腺癌中的表达呈负相关(r=-0.220, P=0.024);性别,年龄、肿瘤直径、组织学类型、病理分期不同的甲状腺癌患者,癌组织中NCAM表达水平差别不显著,差异无统计学意义(t=1.960、0.054 3.335、0.807、0.218,P=0.162、0.816、0.069、0.848、0.641);淋巴结转移情况不同的甲状腺癌患者,癌组织中NCAM表达水平差别显著,差异具有统计学意义(t=8.373,P=0.004);性别、组织学类型、肿瘤直径、年龄、淋巴结转移情况、病理分期不同的甲状腺癌患者,癌组织中B-catenin表达水平差别不显著,差异均无;统计学意义(t=0.258、2.307、0.424、0.741、2.570、0.126,P=0.612、0.511、0.515、0.389、0.109、0.722)。结论NCAM在甲状腺癌中呈低表达,β-catenin在甲状腺癌中呈高表达,NCAM与β-catenin在甲状腺癌中的表达呈负相关,且NCAM的表达与甲状腺癌患者淋巴结转移情况呈相关性。

β-连环素互作蛋白1参与PPARγ转录活性调控及在高糖诱导系膜细胞表型转化中的作用

目的探讨β-连环素互作蛋白1(β-catenin-interacting protein 1,ICAT)在过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)转录活性调控中的作用及在高糖诱导系膜细胞表型转化中的意义。方法将人肾小球系膜细胞分别用常规葡萄糖浓度(5.5 mmol/L,对照组)和高糖(30 mmol/L,高糖组)培养48 h,检测PPARγ、ICAT和β-catenin的mRNA及蛋白质表达变化。观察过表达ICAT和敲减ICAT及β-catenin对上述培养条件下系膜细胞PPARγ转录活性的影响。利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术检测不同分组中细胞表型转化标志物平滑肌动蛋白α(α-smooth muscular actin,α-SMA)表达水平。利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖水平。结果与对照组比较,高糖培养可诱导系膜细胞表型标志蛋白α-SMA的表达上调以及系膜细胞增殖;高糖培养虽对系膜细胞PPARγ蛋白表达水平无影响(P>0.05),但可使PPARγ转录活性明显降低(P<0.01),同时,可抑制系膜细胞ICAT表达和促进β-catenin表达;过表达ICAT可部分升高高糖培养的系膜细胞PPARγ的转录活性(P<0.01);在常规糖浓度条件下,敲减ICAT可降低PPARγ的转录活性(P<0.01),敲减β-catenin表达,同样可降低PPARγ的转录活性(P<0.01);高糖培养条件下,过表达ICAT可抑制系膜细胞α-SMA的表达与细胞增殖。结论 ICAT可能是PPARγ转录活性的重要调控分子之一,并参与介导了高糖诱导系膜细胞表型转化。

弥漫大B细胞淋巴瘤患者DKK-1、βcatenin、Caspase3蛋白表达水平的变化及意义

【目的】探讨弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)悲者DKK-1、β--catenin、caspase 3蛋白的表达情况及其影响因素。【方法】选取在本院接受治疗的DLBCL患者60例为研究对象。观察患者癌组织和癌旁组织DKK-1、β--catenin、caspase3蛋白表达情况。并分析其影响因素。【结果】DLBCL患者癌组织DKK-1、β-catenin、caspase3蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织。且差异均有显著性(P<0.05)。临床分期为Ⅲ+Ⅳ期、体能状态(PS)评分为≥2分、异柠檬酸脱氨酶(IDH)水平升高、国际预后指数(IPI)高危的DLBCI,患者DKK-1、β-catenin,caspase 3阳性表达率较高(P<0.05);不同年龄,性别患者的DKK-1、β-catenin,caspase3阳性表达率相比较差异无显著性(均P>0.05)。多因素Logistica回归分析结果显示临床分期、IDH是影响DLBCL患者DKK-1、β-catenin、caspase3表达的因素(OR=4.865,5.013)。【结论】弥漫大B细胞淋巴瘤患者DKK-1、β-catenin、caspase 3蛋白阳性表达率较高。且受临床分期和IDH的影响。

基于PI3K/Akt通路探讨健脾清热活血方含药血清对人结肠癌SW480细胞增殖、凋亡、周期及P-β-catenin表达的影响

目的:观察健脾清热活血方对人结肠癌SW480细胞凋亡、增殖、周期及P-β-catenin蛋白的影响,探讨该方防治结肠癌可能机制。方法:培养人结肠癌SW480细胞,分别予空白胎牛血清、不同浓度健脾清热活血方含药血清及PI3K阻断剂LY294002干预24 h,MTT法及流式细胞术检测细胞增殖、凋亡及细胞周期,免疫荧光染色法检测P-β-catenin核内转位。结果:健脾清热活血方含药血清组细胞增殖抑制率及凋亡率显著高于空白对照组(P<0.05);同时S期细胞比例显著升高、G1期细胞比例显著降低(P<0.05)。健脾清热活血方含药血清组及LY294002组细胞P-β-catenin以膜表达为主,而空白对照组P-β-catenin以膜表达缺失及核内表达增加为主。结论:健脾清热活血方可能通过调控P-β-catenin核内转录,阻滞SW480细胞周期于G1期,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,从而发挥防治结肠癌的效用。

活血通痹汤塌渍疗法治疗兔膝骨关节炎的效果及其机制

目的观察活血通痹汤塌渍疗法对兔膝骨关节炎的治疗作用,并探讨其可能的机制。方法将72只新西兰大白兔随机分为空白组、模型组、扶他林组、42℃塌渍组、37℃塌渍组、32℃塌渍组,每组12只。除空白组外,其余5组均采用关节制动法建立兔右侧膝骨关节炎模型,建模时间为4周。建模第5周,扶他林组右侧膝关节外用扶他林软膏,1次/d;42℃塌渍组、37℃塌渍组、32℃塌渍组均采用活血通痹汤行塌渍疗法治疗,并调整塌渍时的温度分别为42、37、32℃,1次/d。分组处理28天处死各组动物,观察右侧膝关节软骨大体情况及软骨组织病理改变。取各组右侧膝关节软骨组织,采用real-time PCR法检测Wnt蛋白(Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a)mRNA相对表达量;Western blotting法检测连环素蛋白(β-catenin)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)蛋白表达。结果空白组右侧膝关节软骨大体情况及软骨组织均正常,模型组呈明显骨关节炎改变。42℃塌渍组关节表面较光滑,可见轻度肿胀及滑膜充血;软骨细胞数目较多,分布较均匀,可染色,潮线模糊但有层次;37℃塌渍组、扶他林组、32℃塌渍组均可见关节软骨表面不平整,伴有肿胀及滑膜充血;软骨细胞数量较少,分布比较乱,有局部细胞积聚,潮线较模糊。空白组、42℃塌渍组、37℃塌渍组、扶他林组、32℃塌渍组、模型组膝关节软骨组织Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相对表达量及β-catenin、GSK-3β蛋白相对表达量均依次升高,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论活血通痹汤塌渍疗法治疗兔膝骨性关节炎的效果较好,以42℃条件下的治疗效果最佳;其作用机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关。

散癖平胃方剂对人胃癌细胞株增殖和凋亡的影响

目的 探讨中药散癖平胃方剂（SPPW）对人胃癌细胞株增殖和凋亡的影响。方法 体外培养人胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823，设立3个SPPW质量浓度组（10、100、1000μg/mL）、阴性对照组和5-FU阳性对照组进行干预，MTT比色法检测干预不同时间后各组吸光度（A）值；流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡；透射电镜观察细胞超微结构的改变；Western blot法检测β-连环素蛋白（β-catenin）表达变化。结果 与阴性对照组相比，SPPW作用于胃癌细胞株SGC-7901及BGC-823 12～72h后，对细胞增殖均有抑制作用（P〈0.01）；SPPW干预胃癌细胞株SGC-7901 48h后能促进细胞凋亡，透射电镜下表现出明显的凋亡形态学改变；Western blot法检测β-catenin蛋白表达呈浓度依赖性下降，差异具有统计学意义（P〈0.01）。结论 SPPW可以明显抑制人胃癌细胞株的增殖和促进细胞凋亡，为SPPW的临床应用提供了可靠的理论基础。

喉鳞状细胞癌患者预后的多因素分析

目的:探讨影响喉鳞状细胞癌患者预后的主要因素。方法:采用免疫组织化学SP法检测79例喉鳞状细胞癌患者肿瘤组织和10例癌旁正常组织中细胞S期激酶相关蛋白(Skp2)、p27、上皮细胞钙黏素(Ecad)、α连环素(αcat)的表达,并对可能影响喉鳞状细胞癌患者预后的12项临床病理因素进行单因素和多因素分析。结果:①Skp2在喉鳞状细胞癌和癌旁正常组织中的表达率分别为53.16%和0,p27分别为30.38%和90.00%,Ecad分别为34.18%和100.00%,αcat分别为40.51%和100.00%,其差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。②本组患者总的5年生存率为58.75%,Skp2蛋白低表达组的5年生存率(72.18%)显著高于高表达组(44.17%)(P<0.01);p27蛋白高表达组的5年生存率(72.98%)显著高于低表达组(51.13%)(P<0.01);Ecad及αcat阳性表达组的5年生存率(分别为63.80%和81.74%)显著高于阴性表达组(分别为50.68%和41.09%)(P<0.05和P<0.01)。③单因素分析显示:病理分级,颈淋巴结转移,临床分期,T分期,复发,Skp2、p27、Ecad及αcat表达对患者预后的影响均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);多因素分析显示:复发、Skp2及αcat表达为影响患者预后的独立因素(P<0.05或P<0.01)。④Skp2和p27蛋白表达之间存在着负相关关系(P<0.01);p27和αcat蛋白表达之间、Ecad和αcat蛋白表达之间存在正相关关系(均P<0.01)。结论:复发、Skp2及αcat表达为影响喉鳞状细胞癌患者预后的重要因素。

加味独活寄生合剂对兔膝骨关节炎软骨Wnt3a及β-catenin蛋白表达的影响

目的观察加味独活寄生合剂对兔膝骨关节炎软骨Wnt3a及β-catenin蛋白表达的影响。方法在成功制备兔KOA模型后,80只白兔随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组和独活寄生组,各20只,独活寄生组给予加味独活寄生合剂灌胃,6.8ml/(kg·d),阳性对照组给予盐酸氨基葡萄糖胶囊,0.07g/(kg·d),正常对照组和模型对照组给予等剂量生理盐水灌胃,在实验干预前、干预第2、4、8周,Western Blot法检测Wnt3a及β-catenin蛋白表达。结果HE染色发现独活寄生组关节软骨显微结构得到改善。与模型对照组比较,独活寄生组关节软骨Wnt3a及β-catenin蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论加味独活寄生合剂可调控KOA关节软骨Wnt3a及β-catenin蛋白表达,改善关节软骨显微结构,这可能是其治疗KOA的作用机制。

HIF-1α、β-catenin蛋白在结肠癌组织中的表达及其与临床病理的关系

为分析HIF-1α、β-catenin蛋白在结肠癌组织中的表达及其与临床病理的关系,选取我院2017-2018年收治的结肠癌患者80例。使用腹腔镜获取结肠癌组织标本80份,将其纳入病例组;另获取结肠癌旁正常组织80份,将其纳入对照组,采用免疫组化方法检测2组结肠组织中HIF-1α、β-catenin表达,问卷调查统计患者性别、年龄、肿瘤直径、分期、分化程度、淋巴结转移情况等。结果显示,病例组HIF-1α阳性率、β-catenin异位率高于对照组(P<0.05)。结肠癌组织HIF-1α、β-catenin表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、合并症无关(P>0.05),与TNM分期、分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05)。结肠癌组织中HIF-1α与β-catenin表达具有显著正相关性(P<0.05)。结果表明,HIF-1α、β-catenin蛋白与结肠癌发生、发展密切相关,二者均参与了结肠癌淋巴转移和肿瘤发展过程。

α—catenin在肿瘤中的多种角色

α-连环蛋白（α-catenin）可将钙粘素／B连环蛋白（cadherin／β-catenin）复合体连接于肌动蛋白丝（actinfilament，F-actin），为细胞表面黏附分子与细胞骨架提供了稳固的机械连接。近年，人们对α—catenin的研究发现，其作用不仅仅是稳固cadherin／catenin的结构、参与细胞黏附，还在肿瘤细胞侵袭、迁移中发挥着重要作用。此外，α-catenin还可能参与cadherin／catenin与Ras／MAPK，NF—KB和Wnt等通路之间的串话，涉及了细胞的膜动态、增殖和凋亡的调节。