粗糙脉孢菌漆酶基因的克隆及在毕赤酵母中的初步表达

采用连续延伸PCR方法克隆到粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）漆酶基因，并将其克隆到表达载体pPIC9k，重组质粒经线性化、电激转化Pichia pastoris KM71，部分阳性克隆的PCR结果表明：漆酶基因已整合到巴斯德毕赤酵母染色体上，重组菌经甲醇诱导后3～5d产漆酶量最高，为2-3U／mL。

密码子优化烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达

[目的]烟曲霉(Aspergillus fumigatus)壳聚糖内切酶基因(Chitosanase,EC.3.2.1.132)(csn)的高效表达研究。[方法]根据毕赤酵母密码子的偏爱性对壳聚糖内切酶的基因进行了优化,利用连续延伸PCR方法扩增全长csn基因,构建重组质粒pPIC9k-csn,将重组质粒pPIC9k-csn线性化后转化毕赤酵母GS115,分析重组蛋白的表达,测定其酶活性,并对其酶解产物成分进行分析。[结果]实现了密码子优化后的壳聚糖内切酶的高效表达,重组菌株比野生菌株所产的壳聚糖内切酶活性提高了近20倍。[结论]该研究成功实现了烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达,为工业化大规模生产壳聚糖酶奠定了基础。

透明颤菌血红蛋白（VHb）基因合成及原核生物中的效应

以“连续延伸ＰＣＲ基因合成法”（姚泉洪１９９９），按植物偏爱密码子，合成了全长４４１ｂｐ的透明颤菌血红蛋白（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ＶＨｂ）基因。此方法不需用连接酶，而用高保真ＤＮＡ聚合酶ｐｗｏ及７个长度为９０ｂｐ左右的长寡核酸引物，经一次ＰＣＲ反应即完成了全长为４４１ｂｐ基因合成。ＰＣＲ产物经ＢａｎＨＩ和ＳａｃＩ酶切，克隆入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ载体，合成的ＶＨｂ基因经克隆和测序证实与设计一致。与报道的ＶＨｂ基因相比，核苷酸改动了９８个。Ｇ＋Ｃ含量由原来的４５．３％提高到４７．８％。将该基因克隆入庆大霉素抗性基因启动子后，构建表达载体ｐＹＰ２００１ｈ（ＶＨｂｐ）。将其转入大肠杆菌菌株ＤＨ５α，在氧胁迫、缺乏、充足等三种情况下，绘制其生长曲线，探讨了合成ＶＨｂ基因在原核生物中的效应。结果