集在线荧光分析的连续流动反转录-聚合酶链式反应快速扩增检测食源致病性轮状病毒

采用含RNA反转录(Reverse transcription,RT)和在线荧光分析的连续流动聚合酶链式反应(Poly-merase chain reaction,PCR)微流控技术检测食源致病性轮状病毒。此RT-PCR微流控装置以加热铜块组成恒温带,以聚四氟乙烯毛细管微通道为反应体系构建而成。采用循环水冷却退火区,此装置能获得低至31℃的退火温度,而且温度控制及其稳定性良好,因而能满足不同PCR的要求。为了充分体现PCR微流控技术的优越性,在线荧光分析被用于检测PCR产物。当流速为7.5 mm/s时,轮状病毒RNA的cDNA扩增和在线荧光分析能在约12 min完成(扩增约10 min,在线分析约2 min)。在此集成化的RT-PCR微流控装置上,1 h可完成轮状病毒RNA的RT-PCR以及其扩增产物的在线荧光分析,样品检出限达到6.4×104 copies/μL。

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。

检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)基因组全序列,选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT-PCR,然后用引物P2/P3/P4进行复合套式PCR,建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段,与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT-nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明,有15份类似CDV强毒,5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT-nPCR可以有效检测CDV感染,能够将强、弱毒株区分开,可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。

反转录-聚合酶链式反应检测结直肠癌二氢嘧啶脱氢酶的意义

目的研究结直肠癌患者二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的表达及其临床意义。方法结直肠癌患者42例,于FOLFOX6方案化疗前,取癌组织及癌旁正常组织,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测DPD的表达,观察其与毒性和预后的关系。结果癌旁正常组织DPD的表达高于相应癌组织(P<0.01)。结直肠癌组织DPD的表达状况和各种化疗反应无明显相关性(P>0.05)。正常组织DPD水平和口腔黏膜炎、腹泻的发生呈负相关(P<0.05)。Ⅲ期结直肠癌DPD高表达组和DPD低表达组患者的平均和中位无进展生存期(PFS)分别为28.3个月、27个月和38.6个月、36个月,差异无统计学意义(P>0.05)。结论结直肠癌组织DPD的表达可以预测Ⅲ期结直肠癌患者的预后,而癌旁正常组织DPD的表达可以预测5-FU相关毒性的发生情况。

反转录聚合酶链式反应定量分析巨噬细胞炎症蛋白-2 mRNA

目的:建立反转录聚合酶链式反应定量分析巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)mRNA的方法。方法:以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照,通过优化RT-PCR条件定量MIP-2 mRNA的表达。结果:获取了PCR线性扩增范围,确定了RT-PCR的最佳循环次数和模板量。结论:优化的RT-PCR方法可以用于MIP-2 mRNA的分析。

应用反转录-聚合酶链式反应对LH/CG受体在大鼠垂体中表达的研究

促黄体激素/绒毛膜促性腺激素(LH/CG)受体存在于睾丸和卵巢组织中.然而以往的研究都未报道有关LH/CG受体是否存在于垂体这一重要的内分泌腺体组织中.本研究利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),以大鼠垂体总RNA为模板,扩增LH/CG受体cDNA片段.结果表明:LH/CG受体cDNA不仅存在于卵巢组织中,同样也存在于垂体组织中,垂体组织LH/CG受体cDNA与卵巢组织受体cDNA类似,都是由外显子拼接而成,结果又表明:LH/CG受体cDNA在垂体组织中以较小分子结构(或同工型)形式存在.尽管在大鼠垂体组织中没有发现全长cDNA存在,但本研究提示我们:LH/CG受体分子在垂体组织中的形式可能是由一些不完整的cDNA片段表达而成,并且表达水平较低.

新型反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗方法的建立

对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守区设计1对通用引物,扩增片段为609bp,并在该对引物扩增区域内设计针对疫苗弱毒的特异引物,扩增片段为237bp,建立一种能够区分猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的敏感、特异、重复性好的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别诊断方法。该方法能将我国大陆地区流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒与疫苗弱毒完全区分开来,且不与牛病毒性腹泻病毒及其他猪源病毒发生非特异反应。应用本试验建立的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)方法可以及早对猪瘟作出准确诊断,并可将强毒感染猪迅速从弱毒疫苗免疫猪群中筛选出来,减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。

基于巢式反转录-聚合酶链式反应技术检测葡萄病毒A和葡萄病毒B

皱木复合病在世界范围内普遍发生,是引起葡萄木质部畸形的一类病害的统称,在沙地葡萄、Kober5BB和LN33品种上表现茎痘、茎沟和栓皮等症状,其中葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)与Kober5BB品种上出现茎沟症状有关,而葡萄病毒B(Grapevine virus B,GVB)与LN33品种上出现栓皮症状有关。

Caspase-3和核转录因子-κB在APPSWE转基因小鼠海马内的表达

目的探讨阿尔茨海默病（AD）的发生、发展与神经细胞凋亡之间的规律,以及核转录因子κB（NF-κB）在神经细胞凋亡中的调节作用,为阿尔茨海默病的发病机理和临床治疗提供依据。方法分别取P0、P7、P14、P30、P90、P180日龄的APPSWE转基因小鼠为模型组,各日龄同窝生野生型小鼠为对照组,应用Nissl染色观察其海马结构和锥体细胞形态,免疫组织化学方法检测小鼠海马细胞内半胱天冬氨酸蛋白3（Caspase-3）表达及NF-κB激活情况,RT-PCR检测小鼠海马caspase-3 mRNA的表达。结果模型组及对照组小鼠海马CA3区锥体细胞中凋亡细胞密度和NF-κB阳性细胞密度均随日龄的增大而逐渐下降,在P30后趋于稳定;与对照组相比,模型组凋亡细胞密度和NF-κB阳性细胞密度均增高,自P14以后具有统计学意义（P〈0.01或P〈0.05）;RT-PCR检测小鼠海马caspase-3 mRNA表达结果与Caspase-3免疫组织化学检测结果基本吻合。结论凋亡相关基因caspase-3和NF-κB在阿尔茨海默病的发病机理中起重要作用,NF-κB的激活可能促进神经细胞凋亡。

表没食子儿茶素-3-没食子酸酯抑制小鼠皮肤外伤愈合组织基质金属蛋白酶1的表达

目的探讨50 mg/L表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)对小鼠皮肤外伤愈合组织基质金属蛋白酶1(MMP-1)mRNA表达及MMP-1水平的影响。方法将57只小鼠随机分为对照组(含无损伤组和损伤对照组)、50 mg/L EGCG处理组和辅料组,除无损伤组为3只外,其余各组均为18只,然后分别于损伤后6、12、24、72、120、168 h取损伤愈合皮肤。利用RT-PCR和酶联免疫吸附法(ELISA)检测皮肤外伤愈合期间损伤愈合组织MMP-1 mRNA表达水平和MMP-1含量。结果检测结果表明,50 mg/L EGCG能在皮肤外伤愈合晚期(72 h后)抑制损伤愈合组织MMP-1 mRNA表达,降低MMP-1含量。结论 EGCG对皮肤外伤愈合、晚期愈合组织MMP-1mRNA表达和MMP-1生成具有抑制作用,提示50 mg/L的EGCG能促进皮肤外伤愈合。

转反义Trxs基因小麦灌浆期内源Trxh基因表达及淀粉酶活性的研究

为了进一步揭示反义Trxs基因在抗穗发芽小麦中的作用机理,以转反义Trxs基因的T4代转基因株系（以豫麦70为受体）为材料,运用RT-PCR检测和酶活性测定方法,对其灌浆过程中硫氧还蛋白h（Trxh）基因在不同水平上的表达方式以及α-淀粉酶活性进行了检测。结果表明,转基因小麦籽粒中内源Trxh基因mRNA转录量、Trxh硫氧还蛋白h活性和α-淀粉酶活性均显著低于未转基因的,平均分别比未转基因籽粒下降了21.1%,23.2%和12.6%。其中,花后25-30 d抑制作用最大。回归分析表明,Trxh基因表达量与Trxh活性、α-淀粉酶活性均呈极显著或显著正相关。说明反义Trxs基因的导入干扰或部分抑制了小麦内源同源基因的表达,致使Trxh表达量减少,Trxh活性降低,从而导致了α-淀粉酶活性的降低。

小反刍兽疫病毒RT-nPCR检测方法的建立

为了建立一种适用于临床快速诊断的小反刍兽疫病毒(PPRV)RT-nPCR检测方法,试验依据GenBank公开的PPRV基因序列,针对F基因设计了2对引物,经过反应成分与条件的优化等方法对检测小反刍兽疫病毒的RT-nPCR方法进行了研究。结果表明:该方法检测的极限为4.362×10^-5 ng·μL^-1,羊口疮病毒、山羊痘病毒、口蹄疫病毒和蓝舌病病毒检测为阴性,临床28份样品检测结果有4份样品为阳性,阳性率14.3%。说明成功建立了一种高度特异、灵敏的检测PPRV的RT-nPCR方法。

淀粉样前体蛋白β位分解酶1与β-淀粉样蛋白在糖尿病大鼠脑组织中的表达及行为学相关性

目的观察糖尿病大鼠脑组织淀粉样前体蛋白β位分解酶1(BACE1)、β-淀粉样蛋白(Aβ)的表达,探讨糖尿病糖代谢异常在阿尔茨海默病中的作用机制。方法腹腔注射链脲佐菌素诱发糖尿病大鼠动物模型,随机分为正常组(N组)、假手术组(S组)、4周模型组(M4组)、6周模型组(M6组)、8周模型组(M8组)。穿梭箱实验、Morris水迷宫实验检测大鼠认知行为学改变,免疫组织化学法、免疫印迹法、RT-PCR和酶联免疫吸附法(ELISA)检测BACE1;ELISA法检测Aβ在糖尿病大鼠脑组织中的表达,用图像分析仪测定吸光度值。结果M组大鼠的电击次数、学习和记忆潜伏期时间显著延长(P<0.01),主动逃避次数显著降低(P<0.01);ELISA法检测Aβ1-40和Aβ1-42显示糖尿病模型鼠脑组织内Aβ1-40水平明显增高,从正常组的(64.13±6.76)pg/mg升至模型组的(86.43±7.03)pg/mg(P<0.001);Aβ1-42也明显升高,从正常组的(67.43±5.12)pg/mg升至(89.45±5.28)pg/mg(P<0.001);糖尿病模型鼠脑组织内BACE1水平显著增高,ELISA法从正常组的(116.46±8.10)pg/mg升至模型组的(158.73±6.24)pg/mg(P<0.001)。免疫印迹法吸光度值从正常组的0.61±0.11升至模型组的1.52±0.16(P<0.001),RT-PCR法吸光度值从正常组的1.62±0.26升至模型组的3.61±0.32(P<0.001),免疫组织化学法吸光度值从正常组的0.81±0.21升至模型组的2.01±0.36(P<0.001)。BACE1和Aβ表达水平与学习和记忆负相关。结论BACE1和Aβ在糖尿病大鼠脑组织表达增高,糖尿病糖代谢异常增强BACE1和Aβ表达,参与了阿尔茨海默病的发病机制。

蛋白磷酸酶-2A催化亚基C在小鼠不同器官中的分化表达与定位

目的探讨蛋白磷酸酶-2A(PP-2A)的催化亚基(PP-2Ac)在6只小白鼠不同器官中的表达模式与定位。方法运用RT-PCR、免疫印迹法及免疫荧光技术等实验手段,分别从mRNA水平、蛋白和组织水平进行研究。结果在mRNA水平上,PP-2Ac在大脑中表达最高,卵巢中表达次之,而肌肉、肾脏、脾脏、心脏、肝脏、肺及乳腺中表达相对较低,胃中表达最低;在蛋白水平上,也是大脑中的表达最高,卵巢、脾脏、心脏、肝脏和肺中表达水平相对较高,肌肉、肾脏、乳腺中表达相对较低,胃中表达最低。免疫荧光结果显示,PP-2Ac的表达具有一定的组织特异性和细胞特异性。结论 PP-2A是哺乳动物体内最重要的蛋白磷酸酶之一。

单一连续应激大鼠内侧前额皮质细胞外信号调节激酶磷酸化增高

目的探讨单一连续应激(SPS)大鼠内侧前额皮质(mPFC)磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK1/2)和c-fos表达的变化。方法将45只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、应激组和干预组。应激组和干预组大鼠接受SPS,干预组大鼠接受SPS前30min前额皮质局部注射ERK抑制剂2′-氨基-3′-甲氧黄酮(PD98059)。利用开场实验、高架十字迷宫实验和Morris水迷宫实验检测行为学改变,免疫组织化学和Western blotting检测pERK1/2表达,RT-PCR检测c-fos mRNA表达。结果接受SPS后,大鼠焦虑样行为增强,空间记忆能力减退。应激组大鼠mPFC部位pERK1/2阳性细胞吸光度、pERK1/2蛋白表达量和c-fos mRNA相对表达量分别为51.54±5.41、89.61±3.25和0.91±0.13,显著高于对照组的12.18±1.61、34.22±5.83和0.13±0.03(P<0.01),干预组为26.26±1.42、60.59±5.88和0.35±0.11,显著低于应激组(P<0.01)。结论 PD98059可以阻抑SPS所引起的大鼠行为学改变和mPFC部位pERK1/2及c-fos mRNA表达增高,提示ERK1/2磷酸化在SPS过程中具有重要作用。

L-苹果酸对大鼠转运蛋白及抗氧化酶基因表达的影响

对12月龄SD大鼠给予L-苹果酸30d后,采用含有SYBR Green I的Real Time RT-PCR法,对肝脏和心脏线粒体苹果酸天冬氨酸穿梭中的两种转运蛋白(天冬氨酸谷氨酸转运蛋白(AGC)与α-酮戊二酸苹果酸转运蛋白(OMC))以及两种抗氧化酶(过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px))的基因表达进行检测,以研究L-苹果酸增强线粒体抗氧化作用的分子生物学机制。结果表明:苹果酸组中大鼠心肌细胞AGC、OMC、CAT、GSH-Px的mRNA表达量分别是空白对照组的1.25、1.39、1.12、1.01倍。苹果酸组中大鼠肝脏细胞AGC、OMC、CAT、GSH-Px的mRNA表达量分别是空白对照组的1.33、1.02、1.25、0.94倍。由此推测,L-苹果酸可能通过促进苹果酸天冬氨酸穿梭蛋白以及抗氧化酶的基因表达,实现提高线粒体的抗氧化作用。

猪德尔塔冠状病毒RT-nPCR检测方法的建立与N基因变异分析

建立一种基于猪德尔塔冠状病毒(PDCo V)N基因的RT-n PCR检测方法,对陕西省猪群PDCo V感染情况进行流行病学调查,分析PDCo V流行毒株N基因变异情况。通过病毒分离、检测引物设计、反应体系与条件优化、灵敏性试验和特异性试验,建立了PDCo V RT-nPCR检测方法,并对N基因片段进行序列分析。结果表明:建立的RT-n PCR方法能够扩增出303 bp的N基因目的片段,检测单链c DNA的极限为2.0194×10^(-3)ng·μL^(-1),该方法检测PEDV、TGEV、PRo V、CSFV与PRRSV均无交叉反应,特异性良好;陕西省猪场184份样品检测结果显示,PDCo V阳性率为6.52%(12/184);N基因序列分析发现,获得的HY2019、QLS2020的N基因片段同源性为99.0%,提示可能为同一来源;进化树分析发现,HY2019、QLS2020与我国四川株SCNC201705、Sichuan2017、Sichuan2019同处于一个小的进化分支上,且均存在168~179位“TGTCTGTCTCTA”共12个核苷酸缺失,推测陕西株与四川株高度同源,可能起源于早期四川毒株。

诺如病毒RT-PCR-反向斑点杂交检测方法的建立

旨在建立诺如病毒RT-PCR-反向斑点杂交检测方法。选取诺如病毒较为保守的RdRp基因作为扩增对象,经RT-PCR扩增后将目的片段克隆到pGEM-T载体中。以重组质粒为模版,选择合成寡核苷酸探针及生物素标记引物。生物素标记引物的扩增产物经热变性后与固定在硝酸纤维素膜上的探针进行杂交反应,经显色后判定结果。出现明显的蓝紫色斑点为诺如病毒阳性,如无斑点则为阴性。对5份临床样品进行检测,并以RT-PCR对比验证。结果显示,利用反向斑点杂交法对重组质粒的检测限为100拷贝/μL,在5例实际样品检测中有1例为阳性,与RT-PCR判定结果一致。建立了诺如病毒的RT-PCR-反向斑点杂交检测方法,该方法特异性好,灵敏度高,操作简便,具有重要的应用价值。

创伤后应激障碍模型大鼠内侧前额皮质磷酸化细胞外信号调节激酶1/2及c-fos的变化

目的探讨创伤后应激障碍(PTSD)模型大鼠内侧前额皮质(mPFC)磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)和c-fos的表达变化。方法将30只成年健康雄性Wistar大鼠随机分为对照组(15只)和PTSD模型组(15只),采用无连续单一应激(SPS)方法制备PTSD模型。用免疫组织化学和免疫印迹法检测mPFCpERK1/2的表达变化,RT-PCR检测c-fosmRNA表达变化。结果免疫组织化学分析显示,对照组和模型组pERK1/2阳性细胞数分别为10.4±2.07、48.8±10.08,阳性信号吸光度值分别为24.955±3.691、110.810±10.643,差异有统计学意义(P<0.01);免疫印迹分析显示,对照组和模型组pERK/2相对表达量分别为0.510±0.052和1.109±0.106,差异有统计学意义(P<0.01);RT-PCR分析结果显示,对照组和模型组c-fosmRNA相对表达分别为0.267±0.067和1.049±0.131,差异有统计学意义(P<0.01)。结论mPFCpERK1/2和c-fos表达增高,可能参与了PTSD模型大鼠的病理生理过程。

RT-PCR技术检测猪瘟病毒的应用研究

本试验应用反转录_聚合酶链式反应 (RT_PCR)对猪瘟进行诊断应用研究。应用RT_PCR对来自广西不同地区的 135份疑似猪瘟病料进行检测 ,84份诊断为阳性 ,阳性率 6 2 2 %。从百色、柳州地区等采集的健康猪扁桃体和淋巴结共 2 76份 ,经RT_PCR检测 ,37份为阳性 ,阳性率为 13 4 %。其中健康猪扁桃体带毒较高 ,2 4 6份扁桃体中有 35份阳性 ,占 14 2 %。采自柳州健康猪的 2 6份淋巴结材料全为阴性 ,只有邕宁县的 1份健猪淋巴结阳性。结果表明 ,RT_PCR技术可应用于猪瘟的临床诊断。