连续流动式聚合酶链式反应微流控装置的实验研究

连续流动式聚合酶链式反应（PCR）微流控装置是以低热容量的软薄膜加热器为基础构建3个恒温带，以聚四氟乙烯毛细管微通道为PCR反应体系组建而成。报道了在毛细管微通道中小牛血清蛋白（BSA）动力学表面钝化对PCR扩增的影响，讨论了PCR混合物在毛细管微通道中的流动速度对PCR扩增的影响，在15min甚至10min内成功扩增了长度为249bp的人类β-肌动蛋白片断，扩增时间仅10—15min，而传统PCR仪则需1～2h。

集在线荧光分析的连续流动反转录-聚合酶链式反应快速扩增检测食源致病性轮状病毒

采用含RNA反转录(Reverse transcription,RT)和在线荧光分析的连续流动聚合酶链式反应(Poly-merase chain reaction,PCR)微流控技术检测食源致病性轮状病毒。此RT-PCR微流控装置以加热铜块组成恒温带,以聚四氟乙烯毛细管微通道为反应体系构建而成。采用循环水冷却退火区,此装置能获得低至31℃的退火温度,而且温度控制及其稳定性良好,因而能满足不同PCR的要求。为了充分体现PCR微流控技术的优越性,在线荧光分析被用于检测PCR产物。当流速为7.5 mm/s时,轮状病毒RNA的cDNA扩增和在线荧光分析能在约12 min完成(扩增约10 min,在线分析约2 min)。在此集成化的RT-PCR微流控装置上,1 h可完成轮状病毒RNA的RT-PCR以及其扩增产物的在线荧光分析,样品检出限达到6.4×104 copies/μL。

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

通过鸡胚接种盲传,从重庆某地疑似鸡肾型传染性支气管炎的发病鸡群中,分离到一株病毒,该病毒能导致鸡胚出现侏儒胚。用此病毒回归10日龄雏鸡,可使试验鸡出现典型的花斑肾。尿囊液毒穴36～48h雪经差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心纯化,在电镜下能观察到典型的冠状病毒形态,病毒粒子直径为80～120nm,有囊膜、纤突。应用反转录-聚合酶链式反应穴RT-PCR雪技术扩增出了该病毒的特异性基因M和N,这从分子水平进一步证实引起鸡群死亡的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。

基于核酸检测的微流控芯片设计与传热分析

为了解决传统数字聚合酶链式反应(PCR)扩增过程中移液操作产生的问题以及升降温速率慢的弊端,设计了一种连续流数字PCR微流控芯片,能对包含PCR反应体系的微滴进行快速扩增,可以提升核酸检测过程中的扩增效率。用COMSOL对芯片微通道内部的温度分布和两相流体的共轭传热进行了数值模拟。结果表明,芯片内部能产生95、55和72℃的均匀温区,各个温区的温度变化均在±2℃以内,可以满足PCR的温度要求。微通道内中心区域流体流速最高,且由0.1~20 mm/s变化时,微滴在目标温区的停留时间减少,扩增效率降低。根据仿真结果进行了流速为5、10、15和20 mm/s的实验,仅流速为5 mm/s时符合扩增要求,微流控芯片的扩增效率为PCR扩增仪的98%,扩增时间缩短为扩增仪的18.9%。为进一步开发集微滴生成、扩增和检测于一体的数字PCR设备提供了一种可行的技术手段。

家族性热性惊厥与CAPS基因的相关分析

目的研究CAPS(calcyphsine)基因单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)位点与家族性热性惊厥(febrileseizures,FS)的关系。方法通过NCBI的dbSNP数据库选择CAPS基因的2个单核苷酸多态性位点,应用聚合酶链式反应—限制性内切酶长度多态性技术,检测54例家族性热性惊厥患儿和90名健康对照者的CAPS基因2个SNPs位点的基因型,用SPSS软件判定个单核苷酸多态性基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡,SNPs基因型频率和基因频率在正常人和患儿中的分布比较用R×C和2×2表χ2检验并经连续性校正。结果位点rs7249419的基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡,但是它的最小等位基因频率不足1%,其基因型频率和等位基因频率在正常人和患儿间的分布无显著性差异(P>0·05)。位点rs11437855只有1种基因型,均为无插入的纯合子。结论CAPS基因SNPrs7249419、rs11437855可能与家族性热性惊厥无关。

单温控模块空间构型连续流PCR结构研究

提出了一种新型空间构型连续流PCR结构,该结构将传统二维平面逶迤通道结构转化至三维空间,并基于单温控模块,构筑变性、退火/延伸2个温区,实现符合PCR扩增要求的试样空间温度分布。通过有限元方法详细分析了空间尺寸、通道直径和流体速度对通道内流体温度分布的影响规律,分析表明当该结构几何尺寸为54 mm×58 mm×28 mm,对应壁厚为2 mm×10 mm×2 mm,流体通道直径为1 mm,流体速度为0.0005 m/s时,可实现94.5℃的变性区温度分布和65.5℃的退火/延伸区温度分布,满足核酸分子扩增的温度需求。