连续荧光监测法测定蛋白酶体活性及其在筛选蛋白酶体抑制剂中的应用

目的:建立用连续荧光监测法测定蛋白酶体活性的方法,研究其在筛选蛋白酶体抑制剂中的应用价值。方法:用特异性荧光多肽底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC(Suc-LLVT-AMC)、Z-Val-Val-Arg-AMC(ZVVA-AMC)、Z-Leu-Leu-Glu-βNA(ZLLG-βNA),分别测定蛋白酶体的糜凝乳蛋白酶样(chy-motrypsin-like,CT-L)、胰蛋白酶样(trypsin-like,T-L)和肽基谷氨酰肽水解酶样(PGPH-like,PGPH-L)活性,对测定条件优化,并进行方法学评价。用该法测定了硼替佐米(PS-341)和四嗪二甲酰胺(ZG-DHu-1)对纯20S蛋白酶体和B16、Namalwa细胞蛋白酶体提取物抑制作用。结果:连续荧光监测法测定蛋白酶体活性的最适pH为8.2;0.3g/LSDS仅对CT-L活性有激活作用;CT-L、T-L、PGPH-L的Km分别为3.55、4.12、4.88μmol/L;酶反应进程曲线的线性期达20min;线性范围为测定纯20S蛋白酶体时,其蛋白浓度分别达100、120、100μg/L,测定B16细胞蛋白酶体提取物时,其蛋白浓度均达200mg/L;精密度的批内CV为(2.25～5.78),批间CV在(3.75～8.42)。用该法测定了PS-341对20S蛋白酶体CT-L、T-L、PGPH-L的抑制活性,其IC50分别为12.36、12.42、24.40nmol/L;测定ZGDHu-1对20S蛋白酶体抑制活性,IC50分别为2.24、0.92、0.51μmol/L。结论:连续荧光监测法测定蛋白酶体活性为快速、有效、大规模筛选蛋白体抑制剂类药物提供了一个技术平台,也为临床上应用蛋白酶体抑制剂治疗提供了一个有用的检测指标。

连续荧光监测法测定蛋白酶体活性及其在筛选蛋白酶体抑制剂中的应用

目的建立用连续荧光监测法测定蛋白酶体活性的方法,研究其在蛋白酶体抑制剂筛选中的应用价值。方法用特异性的荧光多肽底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC(Suc-LLVT-AMC),Z-Val-Val-Arg-AMC(ZVVA-AMC),Z-Leu-G1u-Leu-βNA(ZLLC-βNA),用连续荧光监测法分别测定蛋白酶体糜凝乳蛋白酶样(chymotrypsin-like,CT-L)、胰蛋白酶样(trypsin-like,T-L)和肽基谷氨酰肽水解酶样(PGPH-like,PGPH-L)活性,对测定条件最优化,并进行了其方法学评价。用该法测定了目前临床公认的蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib又称PS-341)和课题组自主合成的一种潜在的蛋白酶体抑制四嗪二甲酰胺(ZCDHu-1),对20S蛋白酶体和B16、Namalwa细胞蛋白酶体提取物的抑制作用。结果连续荧光监测法测定蛋白酶体活性的最适pH8.2;0.3gSDS对CT-T活性有激活作用;CT-L、T-L、PCPH-L的K。分别为3.55、4.12、4.88μmol/L;酶反应进程曲线的线性期达20min;酶活性测定的线性范围为20S蛋白酶体的蛋白浓度分别达100μg/L、120μg/L、100μg/L,B16细胞蛋白酶体提取物的蛋白浓度均达200mg/L;精密度批内CV为(2.25～5.78)%,批间CV在(3.75～8.42)%。用该法测定PS-341对20S蛋白酶体CT-L、T-L、PGPH-L的抑制活性,其IC50分别为12.63、12.42、24.40nmol/L;测定ZCDHu-1对20S蛋白酶体的抑制活性,IC50分别为1.24、0.92、0.51μmol/L。结论连续荧光监测法测定蛋白酶体活性的方法为快速、有效、大规模筛选蛋白体抑制剂药物提供了一个技术平台,也为临床上应用蛋白酶体抑制剂提供了一个有用的检测指标。