一种连续蔗糖密度梯度离心分离哺乳动物细胞核糖体前体和核糖体的技术优化

目的利用连续蔗糖密度梯度的方法分离提取哺乳动物细胞的核糖体前体和核糖体。方法采用超速离心法建立连续蔗糖密度梯度，分别用梯度为10％～30％和10％-45％的连续蔗糖密度梯度提取哺乳动物细胞内的核糖体前体和核糖体；然后将哺乳动物细胞裂解液加入到已建立好的连续蔗糖密度梯度上进行超速离心；再将不同沉降系数的核糖体前体和核糖体收集到不同的1．5ml离心管中，测量每一个样品的吸光度值A。并提取其中的蛋白质，利用WesternBlot检测核糖体大亚基蛋白RPL15的定位。结果核糖体大亚基蛋白RPL15位于核糖体前体的60S上和成熟核糖体的60S、80S和多聚核糖体上。结论利用水平转头建立的连续蔗糖密度梯度可快捷分离哺乳动物细胞内的核糖体前体和核糖体。该法分离效果好，操作简单，为快速和大量制备、分离多种核糖体提供了一种良好的方法。

狂犬病疫苗蔗糖密度梯度离心纯化工艺开发

目的:开发冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的连续流蔗糖密度梯度离心纯化工艺。方法:分别比较两种不同初始蔗糖浓度和不同上样速度对纯化效果的影响,初步确定纯化工艺;通过多批次实验确定样品收集范围;比较不同浓缩倍数条件下杂质去除和抗原回收情况,确定合适的收获液浓缩比例;比较不同批次样品纯化后的杂质去除率和重复性,判定本纯化工艺的稳定性。结果:选取60%作为初始蔗糖浓度,在上样速度为150~200ml/min时,可以有效地对10倍浓缩的病毒收获液进行纯化;卵清蛋白、牛血清白蛋白和庆大霉素去除率分别达到99%,95%和95%,且工艺具有极好的稳定性。结论:开发的连续流蔗糖密度梯度离心技术可以作为冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的产业化纯化工艺。

从鼠粪中分离纯化微小隐孢子虫卵囊方法的研究

目的探索一种实用、纯度和回收率高且卵囊活力强的分离纯化微小隐孢子虫卵囊的方法。方法分别采用经典的不连续蔗糖密度梯度离心法、改良饱和盐水漂浮法、氯化铯(CsCl)密度梯度离心法和Percoll密度梯度离心法分离纯化C57BL/6小鼠粪中隐孢子虫卵囊。并将4种方法分离纯化获得的卵囊各105体外感染牛输卵管上皮细胞(BFTE),48h和72h后油镜下观察各分离法卵囊的发育情况,以比较卵囊的纯度和活性。结果经典的不连续蔗糖密度梯度离心法分离获得的卵囊数[(2.86±0.08)×107]与改良饱和盐水漂浮法[(2.88±0.15)×107]无明显差异(P>0.05),但高于Percoll密度梯度离心法[(1.52±0.08)×107](P<0.01)和CsCl密度梯度离心法[(2.46±0.13)×107](P<0.05)。4种方法分离纯化的卵囊体外感染BFTE48h和72h后隐孢子虫数无明显差异(P>0.05)。但CsCl密度梯度离心法纯化的隐孢子虫卵囊纯度明显高于不连续蔗糖密度梯度离心法。结论改良饱和盐水漂浮法较经典的不连续蔗糖密度梯度离心法操作简单、快速;CsCl密度梯度离心法分离的隐孢子虫卵囊纯度较高。