连翘叶片原生质体分离及瞬时转化

【目的】研究高效分离连翘叶片原生质体的条件,并以PEG介导进行瞬时转化,为连翘基因的同源表达提供技术。【方法】以金叶连翘(Forsythia koreana‘Suwon Gold’)组培苗幼嫩叶片为材料,采用4因素3水平L9(3^(4))正交试验,分析纤维素酶质量浓度(15,20,25 g/L)、离析酶质量浓度(3,5,7 g/L)、甘露醇浓度(0.2,0.4,0.6 mol/L)及酶解时间(5,7,9 h)对原生质体分离的影响,探索最优酶解条件,并在此条件下分离原生质体,之后以PEG介导转化pSuper1300::GFP质粒,研究其遗传转化效果。【结果】L_(9)(34)正交试验结果显示,不同处理的金叶连翘叶片原生质体产量为1.17×10^(6)~5.71×10^(6) g^(-1),影响最大的因素为离析酶质量浓度,且4个因素对产量均有极显著影响;原生质体活力为81.19%~90.69%,影响最大的因素为离析酶质量浓度,且其对活力的影响达到显著水平。最佳酶解条件为:在20 g/L纤维素酶、5 g/L离析酶、0.2 mol/L甘露醇的混合液中酶解9 h,在此条件下原生质体产量为5.57×10^(6) g^(-1),活力为86.79%。PEG介导法结果显示,以GFP为报告基因,在转化后的金叶连翘原生质体中可以检测到绿色荧光信号。【结论】获得金叶连翘叶片原生质体分离的最佳条件,且在此条件下原生质体产量、活力较高,能够成功进行瞬时转化。