我国华东与华南地区养殖鱼类迟缓爱德华氏菌分离株的多样性分析

目的对17株来源于我国华东与华南地区的养殖鱼类迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)分离株进行多样性分析。方法通过菌体血清凝集试验及16S rRNA与hsp60部分基因序列的聚类分析。结果菌体血清凝集试验结果显示,鳗源迟缓爱德华氏菌ETY的抗O血清可凝集大部分鱼源迟缓爱德华氏菌;人源迟缓爱德华氏菌标准株ATCC15947的抗O血清仅与鱼源迟缓爱德华氏菌WY37有交叉凝集;鲶鱼爱德华氏菌EIV的抗O血清与鱼源迟缓爱德华氏菌无交叉凝集。2株鱼源迟缓爱德华氏菌AL60306NA1和E29L与以上3种爱德华氏菌抗O血清不发生凝集反应。基于16S rRNA及hsp60部分基因序列构建的系统发育进化树显示,来源于不同地区的绝大部分鱼源迟缓爱德华氏菌分离株进化同源性较高,在基于16S rRNA构建的系统进化树中,山东地区分离自大菱鲆的迟缓爱德华氏菌聚为一支。3株鱼源迟缓爱德华氏菌AL60306NA1、E29L、GK4与人源迟缓爱德华氏菌ATCC15947及人源鲶鱼爱德华氏菌EIV有一定亲缘关系。结论我国华东、华南地区的鱼源迟缓爱德华氏菌分离株普遍具有相似的血清型和较高的进化同源性,并与人源的迟缓爱德华氏菌、人源的鲶鱼爱德华氏菌有明显差异。个别鱼源迟缓爱德华氏菌血清型与分子系统进化分析结果不一致,提示在防控鱼类爱德华氏菌病时,应将菌体表面抗原的免疫原性与分子聚类分析相结合。

黄唇鱼迟缓爱德华氏菌分离鉴定及药敏分析

2023年入夏以来,东莞市黄唇鱼(Bahaba taipingensis)自然保护区救护基地出现黄唇鱼发病和死亡病例,症状主要为食欲下降,体表发红、充血,眼球突出,角膜白浊溃烂,吻部溃烂;解剖后发现腹腔有大量腹水,肝肿大呈褐色。为确定其病因,针对性制定防治措施,采集死亡病鱼的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、鳃丝等组织样品。从病死鱼体内分离到一株优势菌株,命名为DG230920,通过对菌株的形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列综合分析,鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。病理组织学检测结果显示,心脏、肝脏、脾脏、肾脏和鳃均有明显的炎症反应,肠出血、黏膜上皮细胞脱落,脾淋巴细胞稀疏、内皮细胞变性坏死,肾小管变性坏死,鳃见鳃丝脱落、出血。对分离菌株进行药敏分析,结果为对环丙沙星、左氧氟沙星高度敏感,最低抑菌质量浓度仅≤0.25 mg·mL^(-1);其次是厄他培南,最低抑菌质量浓度≤0.5 mg·mL^(-1)。结果表明,黄唇鱼发病原因可能是迟缓爱德华氏菌感染,分离菌株遗传序列稳定,对临床使用的抗菌药物均为敏感。研究提示,应加强黄唇鱼迟缓爱德华氏菌感染的防治,选用敏感药物科学治疗。

迟缓爱德华氏菌荧光PCR方法的建立及初步应用

为构建一种灵敏、特异、准确的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)检测方法,以gyr B为靶基因设计特异性引物和探针,经过优化反应体系和退火温度,建立了迟缓爱德华氏菌荧光PCR方法。随后对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评估,并应用该方法进行临床样品检测。结果显示:当引物和探针浓度分别为250和200 nmol/L,退火温度为55℃时,建立的迟缓爱德华氏菌荧光PCR方法荧光曲线标准,线性关系良好,最低检测限可达12.4 CFU/m L,且1 CFU/m L的细菌经35℃培养1 h后即可被检出;与猪链球菌2型以及无乳链球菌等14种常见水生动物病原体无交叉反应;重复性试验变异系数均小于0.95%;在100份临床样品中,检出阳性22份,与细菌分离鉴定结果一致。结果表明,本研究建立的迟缓爱德华氏菌荧光PCR检测方法敏感性高、特异性强、重复性好,为迟缓爱德华氏菌病的临床诊断和研究提供了技术支撑。

鱼类迟缓爱德华氏菌肠溶口服疫苗的制备及免疫保护效应研究

本文采用海藻酸钠作为载体,采用乳化复沉淀方法包裹迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)全菌制备疫苗微球。制备工艺研究结果表明:3%(m/v)海藻酸钠溶液,4%(m/v)CaCl_(2)溶液,水油相比1∶2,乳化剂Span801%,搅拌速度1200 r/min为最佳制备工艺,微球包埋率达91.04%,微球平均粒径(16.51±11.87)μm。通过人工胃肠液对疫苗微球的耐受性进行分析,微球在体外人工模拟胃液和肠液中16h释放率分别为0.8%和98.1%。用表达有绿色荧光蛋白的大肠杆菌做示踪标记,口灌免疫半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gunther),疫苗能耐受胃的酸性环境影响,通过前消化道到达后肠。免疫保护效应研究表明,口腔灌注疫苗后,出现特异性和非特异性免疫应答,疫苗组在初免后第14天血清效价达到峰值1∶322;外周血白细胞吞噬率在初免后第14天达到峰值27.06%,吞噬指数在初免后第14天达到峰值1.65。初免后第28天用迟缓爱德华氏菌活菌攻毒,对照组死亡率58.82%,疫苗组死亡率13.33%,免疫保护率为77.33%。本研究优化了鱼类肠溶口服疫苗的制备工艺,疫苗免疫评价结果表明,该口服疫苗可以有效激活鱼体免疫反应,预防鱼类疾病发生。

加州鲈源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及药敏试验

加州鲈,学名大口黑鲈,隶属鲈形目、太阳鱼科、黑鲈属,其肉质紧实,味道鲜美,无肌间刺,营养价值高,同时该鱼攻击性强、贪食易上钩,深受消费者和休闲垂钓者的喜爱,是我国广泛养殖的经济鱼类之一。根据2023年渔业统计年鉴显示,2022年我国加州鲈产量已突破80万吨,形成了较大规模的产业链,但病害的发生成为了制约加州鲈养殖业发展的重要因素。

一株黄颡鱼源迟缓爱德华氏菌弱毒株的分离鉴定及特性分析

为探明湖北荆州市某养殖基地患病黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)以烂身、腹水为主要症状且持续性死亡的确切病因,本研究对患病黄颡鱼进行了病原筛查,从患病黄颡鱼组织中分离到一株优势菌,经过形态特征、生理生化鉴定、16S rRNA测序和系统进化分析确定分离菌株为迟缓爱德华氏菌,命名为Et-4。结果显示:分离菌株Et-4具有较强的生物被膜形成能力,不携带esaV、fimA、gadB和katB四种主要的毒力基因。分离菌株Et-4人工感染健康黄颡鱼出现与自然发病类似的症状,并能从病鱼中再次分离出该菌,证实迟缓爱德华氏菌是引起此次黄颡鱼持续性死亡的致病原;分离菌株Et-4对黄颡鱼的LD_(50)为3.9×10^(6)CFU/g,结合毒力基因谱判定其为弱毒株。分离株Et-4携带耐药基因tet A、sulⅠ和add A1,对头孢类药物、庆大霉素、新霉素等敏感;对四环素类、青霉素类、万古菌素等耐药;中药抑菌实验表明乌梅和丁香对迟缓爱德华氏菌Et-4有明显的抑制效果。

aroC基因对迟缓爱德华氏菌生物学特性及致病性的影响

目的:探讨aroC基因在迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda,Et)致病过程中的作用。方法:采用自杀质粒同源重组方法制备Et的aroC基因缺失株(ΔaroC)和aroC的互补株(CΔaroC);通过生物膜形成、运动性、细胞黏附、斑马鱼致病性、组织细菌载量等实验,分析aroC对Et致病性相关的生物学功能的影响。结果:aroC基因的缺失不影响Et生长速度;与野生株和CΔaroC相比,ΔaroC的生物膜形成能力、运动能力、黏附及胞外吲哚生成能力均显著降低(P<0.05或<0.01);qRT-PCR结果显示,相比于野生株,ΔaroC鞭毛合成基因fliA和fliC的转录水平显著下降(P<0.01),但flgK、flgL和fliS基因的转录水平无明显变化(P>0.05);与野生株相比,感染ΔaroC的斑马鱼症状明显减轻、存活率高,且ΔaroC在小鼠肠道和肝脏中的定植数目显著减少(P<0.05或<0.01)。结论:aroC基因影响Et的运动性、生物膜形成、黏附性等,进而调控Et对宿主细胞的致病力。

迟缓爱德华氏菌间接ELISA快速检测法

以迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)WY28作为抗原,免疫新西兰兔,获得效价为1:2048的多克隆抗体;以此多克隆抗体作为一抗,山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗,建立迟缓爱德华氏菌的间接ELISA快速检测法。采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为106CFU·mL-1和1:10000;酶标二抗的最适工作浓度为1:1000。病原菌检测灵敏度为每孔103CFU。该方法标准化后具有快速、灵敏等特性,与肠杆菌科其他细菌参考菌株无交叉反应,具良好的特异性。对养殖场发病大菱鲆(Scophthalmus maximus)和半滑舌鳎中分离的细菌菌株进行检测,从56株分离菌株中检测出27株迟缓爱德华氏菌,阳性检出率为48.2%。该方法的建立有助于快速准确地诊断由迟缓爱德华氏菌引起的养殖鱼类病害。

迟缓爱德华氏菌对HEp-2细胞的侵袭特性

用细胞裂解计数法及超薄切片电镜观察法分析了迟缓爱德华氏菌侵袭HEp—2细胞的基本特性。在15株来源各异的迟缓爱德华氏菌中，有6株细菌具有对HEp—2细胞的侵袭能力。细菌侵入细胞后，主要位于空泡内。侵入细胞内的迟缓爱德华氏菌不仅可在细胞内增殖，而且可从细胞内释放出来。用细胞松弛素破坏微丝后可抑制其侵袭作用，而且表现出剂量依赖关系，而用秋水仙素破坏微管后不影响其侵袭力。这表明在迟缓爱德华氏菌对HEp—2细胞的侵袭过程中，细胞骨架中有微丝的参与，未发现微管的参与。

斑马鱼迟缓爱德华氏菌的鉴定、致病性及药物敏感性

从患病斑马鱼(Danio rerio)肝脏组织分离到菌株Z1,通过对该菌株形态特征、生理生化特性、ATB系统鉴定和16S rRNA、DNA促旋酶B亚单位蛋白(gyrB)基因测序等综合分析,鉴定Z1菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。Z1菌株对健康斑马鱼和透明四带无须鲃(Puntius tetrazona)人工感染试验发现,感染发病症状与自然发病症状一致,再分离菌株的特性与Z1菌株相同,并再次感染成功,证实迟缓爱德华氏菌为斑马鱼病原菌。药敏试验发现Z1菌株对呋喃妥因等11种药物敏感,对苯唑西林等6种药物耐受。15种中草药对Z1菌株的体外抑菌试验结果发现,五倍子、石榴皮的抑菌作用明显,最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)均≤6.25 mg/mL;艾叶等有一定抑菌作用,MIC和MBC均在25～200 mg/mL;而野菊花等抑菌作用不明显,MBC>200 mg/mL。

养殖大菱鲆病原菌迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其疫苗研制

2006年9月山东胶南某养殖场大菱鲆(Scophthalmus maximus)发生病害,从患病大菱鲆脾脏分离出优势菌株WY28,人工感染试验证实WY28菌株对大菱鲆和斑马鱼(Danio rerio)有较强的致病性,其对大菱鲆和斑马鱼的半数致死剂量(LD50)分别为39cfu/g(BW)(3.3×102cfu/ind)和2.1×104cfu/g(BW)(6.4×103cfu/ind)。综合该菌在形态与生理生化特征及16SrDNA同源性等方面的实验结果,确定WY28菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。该菌对先锋霉素V、庆大霉素、氟哌酸、痢特灵等抗生素敏感。WY28菌株经福尔马林灭活制成灭活疫苗,对大菱鲆进行腹腔注射免疫,免疫后第4周测得免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价平均为1∶1280。免疫后第6周,免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价达到更高水平(平均值为1∶3289.6)。攻毒试验表明,受免鱼的相对存活率明显高于对照组。由此可见,利用从病鱼体内分离的迟缓爱德华氏菌菌株制备的灭活疫苗能使大菱鲆较有效抵御迟缓爱德华氏菌强毒株的攻击。

迟缓爱德华氏菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

根据克隆得到的迟缓爱德华氏菌gyrB基因序列设计并合成一对特异性引物,通用性和特异性检测结果显示所设计的引物具有良好的种间特异性和种内通用性,构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,经过反应体系优化后建立了检测迟缓爱德华氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法线性关系良好,在T m为63℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.32x+39.38,相关系数为0.998,扩增效率为1.00,最低能检测到60个拷贝。应用建立的方法对人工感染的大菱鲆病样进行了检测,3个被检样品均呈阳性反应,证明该方法具有较好的适用性。研究表明,所建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量的优点,可用于迟缓爱德华氏菌病的快速检测。

鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕的构建及制备条件优化

菌蜕具有完整细菌表面抗原结构,可诱导机体的体液和细胞免疫应答,成为疫苗制备的候选之一,为了探讨鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕疫苗的可行性,实验采用基因重组技术构建了噬菌体PhiX174裂解酶基因(Lysis E)的温控表达载体,转化迟缓爱德华氏菌,成功制备其菌蜕,并对菌蜕形态、溶菌动力学、裂解效率以及制备条件等进行了研究。结果表明,细菌菌蜕表面形成溶菌孔道,细胞因内容物流失而发生明显的皱缩;构建的迟缓爱德华氏菌诱导后1 h开始裂解,5 h后裂解基本完成,裂解效率为99.99%,冷冻干燥后重悬涂布平板,未检出活菌,电镜观察表明冻干前后细胞形态未见明显变化;构建的迟缓爱德华氏菌分别在OD600值为0.4和0.6进行诱导,其裂解过程和裂解效率没有明显区别;分别用LB、BHI、NB 3种培养基进行比较研究,其中LB培养基制备的菌蜕细胞较完整、裂解完全,是制备迟缓爱德华氏菌菌蜕最优培养基。本研究成功构建了鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕,并对其制备条件进行了优化,为鳗鲡爱德华氏菌病疫苗开发奠定了基础。

罗非鱼迟缓爱德华氏菌的分离与鉴定

从广西某鱼场的发病罗非鱼（Tilapianilotica）中分离到1株呈β溶血的革兰氏阴性杆菌，在普通琼脂平板上生长，菌落圆形，边缘整齐，灰白色，湿润菌落，直径为0．5～1．0mm，有动力，接触酶阳性，赖氨酸及鸟氨酸脱梭酶阳性，还原硝酸盐为亚硝酸盐，发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，经细菌形态、培养特征、生化特性测定结果均符合迟缓爱德华氏菌的特征。应用PCR技术扩增出576bp目的片段，通过PCR产物核苷酸序列测序及Blast比对结果，进一步确定为迟缓爱德华氏菌。致病性试验结果显示分离菌株具有致病性，对氧氟沙星、氯霉素、氟哌酸、恩诺沙星、先锋霉素等高度敏感。

日本鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌与创伤弧菌的分离与鉴定

目的对日本鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的病原进行了分类鉴定。方法对两株病原菌进行了形态、API-ID32E鉴定系统和分子生物学鉴定,分别测定了菌株AnGH080301和An-GH080302的16SrRNA和HSP60基因序列,构建了系统进化树。结果按形态特征和API-ID32E鉴定系统分别初步鉴定菌株AnGH080301和AnGH080302为迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌。菌株AnGH080301的16SrRNA基因部分序列(登录号FJ646618)与迟缓爱德华氏菌的16S rRNA基因(登录号AB050832)同源性最高,达99.7%;菌株AnGH080302的HSP60基因部分序列(登录号FJ646619)与创伤弧菌HSP60基因(登录号BA000037)的同源性最高,达99.8%。结论综合菌株的生理生化特性和分子生物学鉴定结果,可将菌株AnGH080301和AnGH080302分别鉴定为迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌,迟缓爱德华氏菌与创伤弧菌均为人兽共患病病原,其混合感染日本鳗鲡致病的报道尚属首次。

养殖澳洲宝石鱼迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及致病基因的检测

从患病澳洲宝石鱼体内分离到一株致病菌(编号Et4),对该菌的生化特性及致病基因进行检测,并进行了药敏和人工感染实验。结果显示:菌株Et4的生化鉴定结果与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)标准菌株(AY77513)一致;其16S rRNA序列,经同源性比对与迟缓爱德华氏菌核苷酸相似度最高,达99%;根据迟缓爱德华氏菌的致病基因Ⅲ型分泌系统装置蛋白esaV基因序列设计引物,进行PCR扩增,得到708 bp序列,该序列与迟缓爱德华氏菌的esaV基因序列相似性达99.3%,说明菌株Et4具有esaV基因。菌株Et4对环丙沙星等较敏感,对其它药物中度或不敏感,具有较强的致病力(LD50=3.74×104CFU/mL),从病鱼中可以重新分离出此菌。综合形态学、生化特性、16S rDNA序列及致病基因序列鉴定其为迟缓爱德华氏菌。

牙鲆迟缓爱德华氏菌急性感染实验:4种不同方法的比较

为了检验疫苗对牙鲆免疫效果 ,探讨有效的注射途径尤为重要。本文通过采用迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiellatarda)对牙鲆 (Paralichthysolivaceus)进行感染实验 ,对口腔、肌肉、腹腔和腹腔加肌肉4种注射方法进行了评价比较。其半致死浓度 (LD50)分别为口腔灌注法108.38CFU/ml、肌肉注射法107.54CFU/ml、腹腔注射法106.70CFU/ml和腹腔加肌肉注射法106.09CFU/ml。结果表明牙鲆对迟缓爱德华氏菌敏感 ,在这4种注射方法中 。

鸡抗迟缓爱德华氏菌卵黄抗体的应用研究

从全身出血合并腹水的养殖大菱鲆Scophthalmus maximus体内分离出1株细菌,经感染试验证实其病原性,并鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda。采用该菌制成全菌油乳性灭活疫苗,分4次给蛋鸡进行免疫注射,第2次加强免疫后开始收集鸡蛋,制备卵黄抗体(IgY)和其水溶性组分(W SF),并用试管凝集法测定其效价。取效价达到1∶64的鸡蛋提取卵黄抗体,分别采用口服和腹腔注射两种方式给大菱鲆进行免疫:配成含W SF 1 mL/g的饵料,给鱼连续投喂15 d;用含蛋白含量0.19 mg/mL的纯化IgY,于第1、3、14 d对大菱鲆进行腹腔注射,剂量为0.1 mL尾/。免疫后分别用注射和划伤浸泡两种方法攻毒。结果表明,口服特异性卵黄抗体对大菱鲆的免疫保护率分别为83.3%和100%,而注射免疫没有保护作用。

迟缓爱德华氏菌对牙鲆免疫器官的影响

当经口腔灌注大量迟缓爱德华氏菌后 ,牙鲆的头肾和脾脏内的免疫细胞活性增强 ,表现为单核细胞数量增加 ,颗粒细胞内产生大量的颗粒以及颗粒吞噬作用的增强。研究结果还表明 ,病菌也会对免疫器官产生损害 ,可造成细胞水肿 ,膜性结构破坏及细胞坏死。本文详细观察了牙鲆肾、脾、肝、肠及血液的显微结构和肾、脾、肝的超微结构的变化 ,研究结果对疫苗的应用提供了良好的细胞学基础。

迟缓爱德华氏菌的溶血特性

分析了不同来源的２８株Ｅｔ的溶血特性。分别以平板法（ＰｌａｔｅＡｓｓａｙ，ＰＡ）、接触法（ＣｏｎｔａｃｔＨｅｍｏｌｙｓｉｓ，ＣＨ）及上清法（ＳｕｐｅｒｎａｔａｎｔＡｓａｙ，ＳＡ）检测Ｅｔ的溶血性，阳性率依次为７５％、７５％、５７１４％。ＰＡ和ＣＨ的符合率为１００％。凡ＳＡ检测为阳性的，ＰＡ、ＣＨ检测皆为阳性。培养基中加入螯合剂ＥＤＤＡ造成环境缺铁，结果，约３２１４％Ｅｔ的胞外溶血素显著增加。经胰酶、热处理后，ＡＴＣＣ１５９４７株溶血活性丧失，提示Ｅｔ溶血素是一种不耐热蛋白样物质。