Beclin1进化保守区-SA融合蛋白偶联生物素-A10适配子制备PSMA靶向系统及其对前列腺癌细胞的抑制

目的:构建链霉亲和素(streptavidin,SA)与Beclin1进化保守区(evolutionary conserved district,ECD)融合蛋白原核表达载体,将融合蛋白与生物素-前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)特异性适配子A10偶联制备PSMA靶向系统,鉴定其促进PSMA^+前列腺癌细胞凋亡及自噬的功能。方法:采用基因合成技术获得融合基因SA-ECD,克隆至PUC57载体鉴定无误后,再将其定向插入原核表达载体PET30a,IPTG诱导融合蛋白表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blotting鉴定。按照生物素-A10∶SA-ECD摩尔比为4∶1的比例制备PSMA特异性的偶联物即靶向系统,凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证SA-ECD与生物素的结合,流式细胞术、Western blotting、锥虫蓝染色分别检测靶向系统对前列腺癌细胞凋亡、自噬相关蛋白表达和细胞活力的影响。结果:双酶切及基因测序证实重组质粒PET30a-SA-ECD构建成功,IPTG诱导SA-ECD融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并经亲和凝胶层析成功纯化。EMSA实验证明SA-ECD能有效结合生物素-A10。靶向系统可促进PSMA^+前列腺癌细胞凋亡和自噬,同时抑制癌细胞活力。结论:成功表达并纯化融合蛋白SA-ECD,构建的生物素-A10∶SA-ECD靶向系统能够杀伤PSMA^+前列腺癌细胞。

PSMA-a10/TGX221纳米胶粒对人前列腺癌细胞株的靶向性研究

目的探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)适配子a10(PSMA-a10)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)p110β抑制剂TGX221纳米胶粒对人前列腺癌(PCa)细胞株的靶向性。方法取PSMA阳性、阴性的人PCa细胞株(LNCaP、PC-3细胞株),采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测不同浓度的PSMA-a10/TGX221、TGX221对PCa细胞的抑制率,计算药物半数抑制浓度(IC50),以PSMA-a10/TGX221 IC50的1/2为最合适的干预浓度用于后续实验。采用流式细胞术、甲基噻唑(MTT)法、Transwell小室法、Western blot法检测PSMA-a10/TGX221、TGX221、聚丙烯乙二醇(PPG)药物干预对LNCaP细胞、PC-3细胞凋亡、生长、侵袭以及PI3K p110β、Bcl-2蛋白表达的影响。结果在LNCaP细胞、PC-3细胞中,PSMA-a10/TGX221 IC50的1/2分别为1.5、7.0μM。LNCaP细胞中,TGX221组、PSMA-a10/TGX221组细胞凋亡率高于PPG组(均P<0.05),细胞生长指数、侵袭数及PI3K p110β、Bcl-2蛋白相对表达量低于PPG组(均P<0.05);而PSMA-a10/TGX221组细胞凋亡率高于TGX221组(P<0.05),细胞生长指数、侵袭数及PI3K p110β、Bcl-2蛋白相对表达量低于TGX221组(均P<0.05)。PC-3细胞中,TGX221组、PSMA-a10/TGX221组细胞凋亡率明显高于PPG组(均P<0.05),细胞生长指数、侵袭数及PI3K p110β、Bcl-2蛋白相对表达量低于PPG组(均P<0.05);但PSMA-a10/TGX221组与TGX221组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论PSMA-a10/TGX221纳米胶粒对PSMA阳性的PCa细胞具有靶向特异性,可能通过抑制p110β的活性、降低Bcl-2表达来抑制癌细胞的不良生物学行为。