纳米载体逃逸溶酶体机制及其调控的研究进展

纳米载体传递药物或核酸进入细胞,要穿透细胞膜,逃逸溶酶体并进入细胞核,其中逃逸溶酶体是纳米载体发挥作用的关键步骤。近年来,国内外许多学者根据纳米载体逃逸溶酶体的机制,利用大分子对现有纳米载体进行修饰或合成新型纳米载体。本文作者就纳米载体进入细胞的屏障、逃逸溶酶体机制及根据逃逸机制对其进行修饰调控3个方面做进行分析和综述。

纳米载体药物的溶酶体逃逸机制及合成修饰研究进展

纳米载体药物需要穿过细胞膜,通过溶酶体逃逸,最终释放于细胞质才能发挥作用,其中溶酶体逃逸是纳米载体递送药物的关键步骤。具有溶酶体逃逸能力的纳米药物近年来越来越受到研究者们的关注,因此掌握溶酶体逃逸机制并对纳米载体药物进行修饰迫在眉睫。本文对溶酶体的逃逸机制及对纳米载体进行合成修饰两方面进行综述。

具备溶酶体逃逸功能材料的研究进展

目的综述具备溶酶体逃逸功能的载体材料及其逃逸机制。方法以近年来研究文献为基础,对具备溶酶体逃逸功能的载体材料的结构特点、起效机制等进行综述。结果将具有溶酶体逃逸功能的材料进行归类,按其逃逸机制可分为2类:一类是通过提高溶酶体内的渗透压,使溶酶体破裂;另一类是加入具有膜融合功能的材料,降低溶酶体膜的稳定性。结论对于具备溶酶体逃逸功能的载体材料的机制研究仍处于起步阶段,需要进行更深入的探讨,从而促进其研究发展。

光化学内化作用及其在基因输送中的应用

基因药物的细胞内高效输送是基因治疗走向临床转化的关键环节。基因等生物大分子药物往往借助载体以内吞的方式进入细胞,入胞后若不能及时从内涵体/溶酶体中逃逸则极易被降解失活。光化学内化作用(photochemical internalization,PCI)作为一种新兴的光促药物输送技术,利用光照下光敏剂分子产生活性氧破坏生物膜,促进内涵体/溶酶体膜逃逸,从而避免溶酶体中酶对药物的破坏,将生物大分子等药物有效递送到细胞质中。近年来,该技术在基因等大分子药物的细胞内有效可控输送方面取得了一定成效,为基因治疗从实验室向临床应用的转化提供了可能。该文综述了PCI的作用机制及其在基因输送中的应用概况和研究进展。

响应性纳米药物递送系统构建及肿瘤治疗研究

背景恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的重大疾病之一。传统临床手术、放疗及化疗治疗手段仍存在诸多缺陷,如易复发、无靶向特异性、多药耐药性及严重毒副作用等。纳米颗粒药物载体由于其独特的增强渗透性和滞留性(EPR)效应,在提高抗肿瘤药物生物利用率、增强疗效以及减少毒副作用方面发挥着重要作用[1]。智能药物递送系统一般以纳米颗粒为药物载体,通过多功能修饰手段整合诸如刺激响应性释放机制以及靶向分子等策略来构建。介孔硅纳米颗粒、铁磁纳米颗粒以及聚合物胶束等常被用作抗肿瘤纳米药物载体,受到人们广泛关注。抗肿瘤药物载体与宿主肿瘤及正常细胞/组织相互作用,与载体表界面性质密切相关。纳米药物载体的细胞或免疫毒性、药物泄露的毒副作用,亟需避免。同时,载体在体内转运过程中需历经循环(清除)、组织(渗透)及细胞层面(胞吞、释药)等各级生物屏障,亟待克服[2]。因而,如何优化药物载体及表界面设计,提高载体的生物安全性与有效性,克服诸多生物屏障,利用肿瘤微环境生理信号(GSH、pH、酶、ROS等)触发药物定点释放,提高药物生物利用度,是发展高效药物控释系统的关键科学问题。结果和讨论受肿瘤微环境启发,课题组提出以细胞外基质生物大分子表面功能化药物控释载体的新策略。以细胞外基质组分胶原作为纳米介孔硅(MSNs)封堵剂、天然半乳糖酸为靶向分子构建的氧化还原响应性药控系统,显著地提高了系统的生物相容性及肿瘤细胞的摄取量,降低了对正常细胞的损害。后续研究以细胞色素、肝素、白蛋白等表面功能化介孔硅载药系统,有效地提高了细胞吞噬、诱发细胞凋亡、抑制肿瘤生长及降低对正常组织(肝、肾、脾、肺等)的毒副作用。更重要的是,以明胶、牛血清白蛋白及溶菌酶等天然蛋白修饰的MSNs颗粒,显著地降低药物载体的免疫毒性。利用转铁蛋白表面功能化中空介孔硅(HMSNs),实现靶向药物输送及肿瘤抑制,并降低炎症响应。随着逐步深入理解肿瘤的复杂性,意识到除提高药物控释系统的生物安全性外,如何优化药物载体及表界面设计,克服肾清除、单核细胞系统清除、肿瘤异质化致密细胞外基质、细胞膜障碍、内涵体包裹及多药耐药性等时序性生物障碍,最终提高药物有效递送效率,亟待深入探究。针对肿瘤致密细胞外基质导致纳米药控系统难以渗透至肿瘤深处的问题,采用吉西他滨加载的HMSNs大颗粒携带顺铂前药-树枝状分子小颗粒(10 nm)策略,制备了尺寸可变的复合纳米系统。在肿瘤弱酸条件下,聚合物电荷反转,释放顺铂前药小颗粒,实现肿瘤深层渗透和释药,抑制肿瘤生长。进而,鉴于免疫抑制是肿瘤疗效差和复发的重要因素,课题组利用PCPP胶束加载免疫检查点PD-L1 siRNA和线粒体靶向光敏剂MTPP,构建了尺寸变小/电荷增高、具有增强肿瘤渗透的pH响应性药物递送系统。PCPP胶束在肿瘤微酸性条件下,剥离外层PEG,暴露PEI中间层,导致其尺寸变小和表面正电荷增加,提高肿瘤渗透和细胞摄取。胶束在溶酶体低pH值环境质子化,触发溶酶体逃逸,胞内释放siRNA及MTPP,解除肿瘤免疫抑制。通过光动力(PDT)产生大量ROS,诱导细胞凋亡,暴露相关抗原及加速抗原递呈,激活抗肿瘤免疫响应,实现对肿瘤细胞的高效免疫杀伤[3]。该光动力-免疫联合治疗策略为抑制肿瘤生长及复发提供新思路。针对肿瘤低氧微环境,利用聚苯硫醚(PSS)在单线氧或ROS氧化作用下从疏水向亲水转变的特性,制备了靶向胶束药控系统,实现细胞溶酶体逃逸释药,抑制肿瘤生长。利用喜树碱(CPT)前药策略,引入pH敏感和溶酶体逃逸的多叔胺PDEA大分子,构建了肿瘤细胞膜、线粒体双靶向的pH/GSH级联响应性胶束药物递送系统。借助PDT效应,激活线粒体损伤介导的Caspase-9/3凋亡通路,实现化疗和PDT联合治疗,抑制肿瘤生长。以普鲁士蓝中空纳米颗粒(PHPBNs)加载葡萄糖氧化酶(GOx),透明质酸高分子封堵及靶向,并链接PEG提高其循环时间,构建了克服低氧环境的药控系统,实现自增强'饥饿'和低温光热的肿瘤联合治疗。具体讲,释放的GOx消耗肿瘤组织内氧气、葡萄糖及ATP水平,而PHPBNs分解肿瘤组织间H2O2为氧气,强化'饥饿'效应。同时,该系统还显著抑制热休克蛋白的表达,提高肿瘤对低温热疗的敏感性[4]。基于环糊精的疏水性空腔结构和超分子自组装,在Fe304纳米颗粒表面以双硫键接枝由聚乙烯胺和β-环糊精(PEI/β-CD)组成的纳米储存器,加载喜树碱药物。PEI分子的'质子海绵效应',使载药系统从细胞内涵体逃逸,实现胞内释药,诱导细胞凋亡及肿瘤抑制。利用四甘醇分子与α-环糊精组成的分子机器封堵中空介孔硅,以'点击化学'接枝叶酸分子,实现药物高效加载和体内/外还原响应性靶向释物,抑制肿瘤生长。基于药控系统在肿瘤微环境转运过程中级联pH变化,设计了以β-CD为封堵剂的PH级联响应性HMSNs药控系统。利用肿瘤微环境弱酸性(PH 6.8)使PEG保护层脱落,实现电荷反转,克服细胞膜障碍,提高细胞摄取;内涵体低酸性使β-环糊精脱落,胞内原位释药,诱导细胞凋亡及抑制肿瘤。基于肿瘤微环境金属基质蛋白酶(MMP)过量表达,利用含细胞穿膜肽及MMP裂解底物多肽设计了MMP-2/-13响应性药控系统,提高其血液稳定性,降低巨噬细胞激活及吞噬,抑制肿瘤生长。针对耐药性问题,设计了多功能硅包金复合纳米药控系统。颗粒表面的功能聚合物(CS(DMA)-PEG)可提高血液稳定性,改性功能肽RLA既增加细胞摄取又靶向线粒体,在NIR照射下实现多重协同增强的光热-光动力治疗。利用介孔聚多巴胺纳米颗粒,借助π-π堆积和疏水作用,实现阿霉素和肿瘤耐药抑制剂的高效加载,实现对多药耐药肿瘤细胞的光热-化疗的协同抑制。最近,利用前药胶束加载β-拉帕醌,构建pH/ROS级联响应性药物递送系统,实现自增强氧化-化疗联合抗肿瘤治疗,并克服肿瘤多药耐药性[5]。结论针对药物载体潜在的生物安全性,提出细胞外基质生物大分子表面功能化的新策略。针对克服肿瘤生物屏障(循环、组织及细胞层面)药物载体及表界面设计,提出剥离性PEG保护层、白蛋白表面功能化、颗粒尺寸变小、电荷反转、局部送氧、级联双靶向、溶酶体/内涵体逃逸、PDT/免疫联合治疗等策略。

鱼精蛋白硫酸盐对DNA纳米结构入胞能力及胞内溶酶体逃逸的影响

目的 探究鱼精蛋白硫酸盐对四面体框架核酸入胞能力及胞内稳定性的影响.方法 取3日龄C57BL小鼠肢端软骨进行软骨细胞培养,并收集第1~2代细胞用于实验.利用4条DNA单链S1(标记Cy5荧光)、S2、S3、S4,经过退火程序合成四面体框架核酸并超滤提纯.用高通量毛细电泳验证四面体框架核酸合成并拍摄透射电镜图进行表征.向新合成四面体框架核酸中缓慢滴入1 mg/mL鱼精蛋白硫酸盐溶液(以原子数N/P=5/1混合),检测Zeta电位.将细胞分为3组:细胞中加入100 nmol/L经过鱼精蛋白硫酸盐孵育的四面体框架核酸作为实验组1;细胞中加入100 nmol/L未经孵育处理的四面体框架核酸为实验组2;对照组细胞不进行加药处理.在加药后6 h及12 h,用流式细胞术定量检测胞内Cy5荧光,并取部分12 h组细胞,进行免疫荧光染色,于激光共聚焦显微镜下定性观察分析胞内Cy5荧光.加药5.5 h及11.5 h后,加入溶酶体探针对活细胞溶酶体进行染色,30 min后(6 h及12 h)观察Cy5荧光与溶酶体位置关系.结果 经过鱼精蛋白硫酸盐孵育处理后,溶液Zeta电位由负转正,即由(-1.567±0.163)mV转为(4.700±0.484)mV;在6 h及12 h两个时间点,流式细胞仪检测到实验组1胞内四面体框架核酸荧光强度均高于实验组2,差异有统计学意义(P<0.05).12 h的免疫荧光染色观察结果与流式细胞术检测结果一致.溶酶体染色结果显示,加药6 h及12 h后,实验组1的Cy5荧光与溶酶体位置重叠现象较实验组2更少;且12 h后,实验组1依然可见大量Cy5荧光,而实验组2的Cy5荧光较少较弱.结论 鱼精蛋白硫酸盐孵育处理可有效提升四面体框架核酸入胞能力,并在一定程度上实现四面体框架核酸胞内溶酶体的逃逸.

基于原位聚合技术构建细胞内微环境响应型DNA递送系统

传统的非病毒载体基于分子间静电自组装作用与核酸结合,组装的复合物在体内复杂的环境中容易发生结构解离,共价结合的交联聚合物载体有望成为解决传统非病毒载体结构稳定性差的有效方案。选择N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、1-乙烯基咪唑、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱与N,N′-双(丙稀酰)胱胺作为多功能性单体,采用原位聚合方法制备包载质粒DNA(pDNA)的交联聚合物-pDNA复合物。其中,共价键为载体提供优异的结构稳定性;1-乙烯基咪唑能够响应胞内溶酶体酸性微环境,触发质子海绵效应便于复合物的溶酶体逃逸;N,N′-双(丙稀酰)胱胺的二硫键可以响应胞内高水平的谷胱甘肽(GSH),实现复合物在细胞内部选择性解聚,释放内含pDNA。研究表明,该复合物平均水合半径约135 nm,ζ电势约−6.5 mV,形貌近似球形。该复合物可在10 mg/mL肝素环境中保持结构稳定性,具有响应细胞内GSH,触发释放包载核酸分子的功能。细胞实验证明该复合物细胞毒性低。细胞摄取、转染能力强。综上所述,基于原位聚合技术制备交联聚合物载体在基因递送领域具有重要应用前景,本研究为新型基因递送载体的开发提供了新思路。

兼有线粒体靶向、溶酶体逃逸功能的姜黄素TPP-PEG-PE纳米胶束的制备及促乳腺癌细胞凋亡的研究

采用正交试验优选姜黄素TPP-PEG-PCL纳米胶束的工艺参数,再系统检测姜黄素TPP-PEG-PCL纳米胶束的粒径、电势及电镜下形态,研究姜黄素TPP-PEG-PCL纳米胶束的稳定性、体外释放情况;以DID荧光染料作为探针,采用流式细胞技术研究乳腺癌细胞对纳米胶束的摄取,采用激光共聚焦显微技术研究纳米胶束的线粒体靶向性和溶酶体逃逸功能;在等给药剂量条件下,评价姜黄素TPP-PEG-PCL纳米胶束促乳腺癌细胞凋亡效果。正交试验优选的姜黄素TPP-PEG-PCL纳米胶束粒径为(17.3±0.3) nm,Zeta电势为(14.6±2.6) mV,该纳米胶束在透射电镜下表现为规则圆球型;荧光试验结果显示,TPP-PEG-PCL纳米胶束可以促进药物的细胞摄取、逃逸溶酶体的捕获,靶向线粒体;细胞存活率和Hoechst染色阳性试验结果均显示,姜黄素TPP-PEG-PCL纳米胶束具有很好的促乳腺癌细胞凋亡作用,姜黄素TPP-PEG-PCL纳米胶束能显著降低乳腺癌细胞线粒体膜电位、提高细胞色素C的释放,明显增加促凋亡蛋白Bcl-2、减少抗凋亡蛋白Bax的表达,这些试验结果均明显优于姜黄素PEG-PCL纳米胶束和姜黄素,具有统计学意义。该研究结果揭示姜黄素TPP-PEG-PCL纳米胶束能很好的靶向乳腺癌细胞线粒体、逃逸溶酶体的捕获,从而增强药物促肿瘤细胞凋亡效果。

壳寡糖的免疫佐剂效果及作为减毒活菌载体疫苗佐剂的可行性探索

目的 探究壳寡糖(chitosan oligosaccharide, COS)的免疫佐剂效果,包括免疫激活作用和引发溶酶体逃逸作用,并探索其是否可以作为减毒活菌载体疫苗佐剂。方法 (1)以0(对照组)、0.1~4 mg/mL COS培养小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞24 h,利用CCK8实验检测细胞活力的影响;以0(对照组)、1、2、4 mg/mL COS干预小鼠RAW264.7细胞24 h,通过RT-qPCR实验检测细胞因子IFN-γ、IL-10、TGF-β、TLR-4的mRNA表达水平。(2)RAW264.7细胞加入1 mL含有不同组分[钙黄绿素(Calcein)50μg/mL,COS 2 mg/mL,阻断剂bafilomycin A1 1μmol/mL]的PBS培养,分组为Calcein组、Calcein+COS组、Calcein+COS+Bafilomycin A1组。通过激光共聚焦显微镜观察RAW264.7细胞在有或无COS干预下对荧光染料Calcein的吞噬和胞内荧光分布情况,判断COS是否能够引发溶酶体逃逸。(3)用0.5、1、2、4、8 mg/mL COS包被减毒李斯特菌载体宫颈癌治疗性疫苗候选株LM?E6E7和LI?E6E7,测定Zeta电位变化,选择COS成功包被细菌的质量浓度。检测2 mg/mL COS包被LM?E6E7和LI?E6E7前后,RAW264.7细胞对疫苗菌株的吞噬率。结果 (1)CCK8结果显示,与对照组相比,不同质量浓度COS干预RAW264.7细胞24 h后,对细胞无毒性,并能够促进细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.05);RT-qPCR结果表明,与对照组相比,COS干预能够上调RAW264.7细胞TLR-4和IFN-γ的mRNA水平,同时抑制TGF-β和IL-10的mRNA表达水平,以4 mg/mL COS组最为明显(P<0.05)。(2)激光共聚焦显微镜发现在COS干预下,Calcein+COS组比Calcein组有更多的荧光染料从溶酶体内释放进入胞内,而这个过程可以被bafilomycin A1阻断。(3)Zeta电位结果表明COS质量浓度达到2 mg/mL时,能成功包被到细菌表面。疫苗株被COS包被前、后,RAW264.7细胞对LM?E6E7的吞噬率分别为5.70%和22.00%,差异有统计学意义(P<0.05);RAW264.7细胞对LI?E6E7的吞噬率分别为1.55%和6.12%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 COS具有激活巨噬细胞免疫应答和引发溶酶体内物质逃逸溶酶体的作用,包被减毒活菌载体疫苗候选菌株可促进巨噬细胞对细菌的吞噬,可望进一步开发作为细菌载体类疫苗佐剂。

人参皂苷Rg_(3)脂质体靶向递送双氢青蒿素与紫杉醇用于三阴性乳腺癌的治疗

利用中药活性成分人参皂苷Rg_(3)完全代替胆固醇作为脂质体膜材料,制备同时负载双氢青蒿素与紫杉醇的人参皂苷Rg_(3)脂质体,并评价其对三阴性乳腺癌的体外抗肿瘤作用。采用薄膜水化法制备脂质体,单因素试验优化脂质体处方工艺,对其粒径、Zeta电位和稳定性等理化性质表征,评价药物在多种介质(pH 5.0、7.4)中的释放行为。以CCK-8方法检测其对MDA-MB-231细胞和4T1细胞的增殖抑制作用。以细胞划痕实验评价其对MDA-MB-231细胞和4T1细胞迁移能力的影响,并进一步评价脂质体的靶向能力和溶酶体逃逸机制。利用H9c2细胞对制剂潜在的心肌毒性进行安全性评价。所制备的脂质体呈类球状、粒径均匀分布,平均粒径为(107.81±0.01)nm,Zeta电位为(-2.78±0.66)mV,双氢青蒿素和紫杉醇的包封率分别为57.76%±1.38%和99.66%±0.07%,总载药量为4.46%±0.71%,双氢青蒿素和紫杉醇的累积释放度在pH 5.0条件下优于pH 7.4,低温下储存7 d稳定性良好。给药24 h后,当双氢青蒿素的浓度为70μmol·L^(-1)时,负载双氢青蒿素与紫杉醇的人参皂苷Rg_(3)脂质体对MDA-MB-231细胞和4T1细胞的增殖抑制率显著高于阳性药阿霉素和游离药物(P<0.01)。与游离药物相比,脂质体能显著抑制MDA-MB-231细胞和4T1细胞的迁移(P<0.05)。脂质体具备主动靶向性和较好的“溶酶体逃逸”功能。特别是,相比于游离药物,脂质体对心肌细胞毒性明显降低(P<0.05),证明制剂具有降低心肌毒性的潜力。该研究证明了人参皂苷Rg_(3)作为脂质体药物处方中脂类的良好替代品的“药辅合一”特性,进一步推动治疗肿瘤的中药创新药物发展。

用于肿瘤治疗的siRNA纳米输送系统

人类恶性肿瘤的发生发展过程涉及多种基因的表达和功能异常。小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)通过碱基配对的作用方式干扰特定胞浆内信使RNA(mRNA),从而介导基因沉默,其研究在肿瘤治疗的研究和应用中取得了突出进展。然而,siRNA体内给药仍存在诸多问题,相应的siRNA输送系统呈现出多样化发展趋势。本文总结归纳了肿瘤治疗研究中各种不同的siRNA纳米输送策略,包括提高肿瘤靶向性、增强细胞摄取效率和改善溶酶体逃逸能力等方面,旨在为设计新型siRNA纳米输送系统提供参考。

pH值响应释药As_2O_3聚乙二醇-聚己内酯-聚乙烯亚胺纳米粒的制备及体外评价

目的制备包载As_2O_3的聚乙二醇-聚己内酯-聚乙烯亚胺(PEG-PCL-PEI,PPP)纳米粒(As_2O_3-PPP-NPs),并进行体外评价。方法以PPP三嵌段聚合物为载体材料,通过静电载药原理一步制备As_2O_3-PPP-NPs;电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定纳米药物的载药量与包封率,透析袋法考察其体外释药特性;紫外分光光度法测定As_2O_3-PPP-NPs的溶血毒性;噻唑蓝(MTT)法考察As_2O_3-PPP-NPs对人宫颈癌细胞HeLa和人肝癌细胞HepG2的细胞毒性;采用ICP-OES以及共聚焦显微镜考察HepG2细胞对As_2O_3-PPP-NPs的摄取效率以及摄取机制。结果所制备的As_2O_3-PPP-NPs呈类球形,分散良好,粒径约为88.7 nm,包封率和载药量分别为(92.75±3.83)%和(4.39±0.26)%。体外释放研究表明,As_2O_3-PPP-NPs具有缓释以及低pH响应释药的特征,能够实现肿瘤环境的特异性释药。溶血实验表明,As_2O_3的负载中和了PPP材料的正电性,从而降低了溶血毒性。细胞毒性试验表明As_2O_3-PPP-NPs对HeLa细胞和HepG2细胞的半数抑制浓度(IC50值)分别为6.24、5.85μmol/L,具有较理想的抑制肿瘤细胞生长的作用。细胞摄取研究表明,As_2O_3-PPP-NPs因表面荷正电,容易被细胞摄取迅速,并具备溶酶体逃逸的特性,能实现As_2O_3在细胞浆中释放从而发挥药效。结论 As_2O_3-PPP-NPs展现出显著的缓释以及低pH响应释药的特性,并具有溶酶体逃逸的特征,是一种有潜在价值的抗实体瘤纳米递药体系。

铝佐剂颗粒化乳液制备及其免疫效果研究

铝佐剂是我国唯一临床批准使用的疫苗佐剂,但其自身难以引发有效的细胞免疫应答,无法对机体产生综合性的保护,难以满足日益增长的疫苗佐剂需求。因此,如何合理化改造铝佐剂,保证疫苗佐剂的安全及高效诱导免疫反应是亟待解决的问题。本工作通过对商品化铝佐剂制备乳液超声条件的优化,最终研究表明当颗粒浓度为2.0 mg/mL,水相缓冲液选择蒸馏水且pH为7.0时能制备得到稳定的颗粒化乳液(Alum Particulate Emulsion,APE),制备得到的乳液平均粒径为2723.7±435.3 nm,Zeta电位为+40.5±1.5 m V。离心发现此时体系中没有游离的铝佐剂,表明2.0 mg/mL是能稳定乳液的最小颗粒浓度。将乳液与抗原共混,测量抗原的吸附率,结果显示,抗原的吸附率接近100%,共聚焦的结果也验证了乳液对抗原的高吸附特性。当乳液与DC(Dendritic Cells)细胞共孵育,可以观察到乳液的内吞及溶酶体逃逸,而传统的铝佐剂无法实现。ELISpot结果显示,APE组脾细胞中分泌IFN-γ的T细胞数量比铝佐剂组增加300%左右。将铝佐剂通过颗粒化的策略制备得到APE以后,改变了佐剂增强抗原的免疫效果,显著提升了传统铝佐剂的细胞免疫效果。

混合胶束递送siRNA的体外研究

目的制备混合胶束(PHM),考察其负载小干扰RNA(siRNA)的能力及所形成的复合物在树突状细胞(DC)上摄取、溶酶体逃逸及沉默的能力。方法采用溶剂注入法制备PHM,胶束亲水端带正电的聚乙烯亚胺与通过静电吸附作用复合siRNA形成载药胶束,考察载药胶束的粒径、多分散系数(PDI)和Zeta电位;通过核酸凝胶电泳确定PHM对siRNA的包载能力;考察复合物在小鼠树突状细胞系DC2.4上摄取、溶酶体逃逸和沉默的能力。结果PHM-siRNA的平均粒径为123.7±3.4 nm,PDI为0.212±0.052,Zeta电位为13.4±2.3 mV。核酸凝胶电泳显示:氮磷比(N/P)为8:1时,PHM能完全包载siRNA。制剂在DC2.4细胞上的摄取率为50.79%±5.71%(N/P为8:1)和95.22%±1.27%(N/P为16:1),选择N/P为16:1进行后续实验。共聚焦显微镜观察结果显示:制剂可以在给药后15 h从溶酶体中逃逸出来。实时荧光定量PCR检测到PHM-siRNA对目标基因的沉默效率为66.9%±8.8%。结论PHM-siRNA均一稳定,在DC2.4细胞上具有较高摄取、溶酶体逃逸及沉默的能力。

利用共聚焦显微镜研究siRNA/CLDs复合物的胞内分布（英文）

研究siRNA在胞内的运输过程有助于阐明其在细胞质基质中的动力学性质及过程。本文报道了激光共聚焦扫描显微镜技术用于研究siRNA及其肽缀合物与胱氨酸骨架阳离子脂质体递送系统(siRNA/CLD)的胞内分布过程。发现siRNA在胞质内分布动力学与3′-单肽-siRNA缀合物/CLD递送系统的入胞途径紧密相关,其中具有较好抗肿瘤活性的3′-p As-siRNA/CLD,具有较快的细胞摄取及溶媒体逃逸过程,并能在A375细胞中潴留较长的时间。该方法高效、可定量并可视化,不仅能够测定siRNA在胞内的浓度,也能够定量分析其与细胞亚结构的共定位关系,进一步可系统研究siRNA及其缀合物在胞质内的动力学分布过程。

具有线粒体靶向功能的载去甲斑蝥素TPP-PEG-PCL纳米胶束促肝肿瘤细胞凋亡研究

目的制备去甲斑蝥素(3-丙羧基)三苯基溴化膦(TPP)-聚乙二醇-b-聚己内脂(PEG-PCL)纳米胶束,研究其体外释放、细胞内转运及促肝肿瘤细胞凋亡作用。方法采用薄膜水化法制备去甲斑蝥素TPP-PEG-PCL纳米胶束,测定粒径、Zeta电位及显微电镜形态分析,同时对胶束进行稳定性、体外释放、药代动力学和临界胶束浓度测定;以香豆素-6作为荧光探针,评价TPP-PEG-PCL纳米胶束在肝肿瘤细胞内的摄取、溶酶体逃逸及线粒体靶向功能;采用给药剂量等同条件下,评价去甲斑蝥素TPP-PEG-PCL纳米胶束促肝肿瘤细胞凋亡效果。结果去甲斑蝥素TPP-PEG-PCL纳米胶束粒径为(16.8±0.2)nm,Zeta电位为(14.3±0.2)m V,透射电镜图片该纳米胶束呈规则圆球型;荧光试验结果显示,TPP-PEG-PCL纳米胶束可以促进药物的细胞摄取、逃逸溶酶体的捕获,最终靶向聚集在线粒体部位;细胞存活率和Hoechst染色结果显示去甲斑蝥素TPP-PEG-PCL纳米胶束具有很好的促肝肿瘤细胞凋亡作用,去甲斑蝥素TPP-PEG-PCL纳米胶束可以明显降低线粒体膜电位、提高细胞内活性氧(ROS)水平、增加促凋亡蛋白Bcl-2、减少抗凋亡Bax蛋白的表达,这些促凋亡相关的实验结果均明显优于去甲斑蝥素PEG-PCL纳米胶束和去甲斑蝥素,具有统计学意义。结论去甲斑蝥素TPP-PEG-PCL纳米胶束具有良好的肝肿瘤细胞线粒体靶向性和促肿瘤细胞凋亡作用,为一种潜在高效靶向肿瘤细胞线粒体的载药系统。

载血卟啉单甲醚电荷反转型纳米载体构建及评价

构建具有电荷反转功能的纳米载体,实现药物的溶酶体逃逸,提高抗肿瘤效果。合成胆固醇-聚乙烯亚胺-六氢邻苯二甲酸酐(Chol-PEI-HHPA)聚合物,利用1H NMR进行结构表征,构建具有电荷反转功能的脂质体(Lipo-HHPA)并负载声敏药物血卟啉单甲醚(HMME),考察Lipo-HHPA-HMME在不同p H条件下的电荷反转情况,利用MCF-7细胞研究载体的溶酶体逃逸及细胞毒性。结果显示,所构建的Lipo-HHPA外观均匀,平均粒径为102 nm,在超声激发下可实现HMME的突释;当pH从7.4变为4.5时,其表面电位由-23.5 mV反转为+21.2 mV;体外细胞实验结果显示,Lipo-HHPA可逃逸溶酶体降解,提高HMME的细胞毒性。以上结果表明,电荷反转型载体有利于增强药物的细胞毒性,提高抗肿瘤效果。