人PTEN基因RNA干扰及其RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人PTEN基因RNA干扰(RNAi)及其逃避RNAi策略结构(RESC)救援的慢病毒载体。方法:利用Invitrogen公司在线软件,针对已筛选确定的PTEN基因RNAi有效靶序列,设计并合成靶序列的oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XbaⅠ和XhoⅠ酶切后的pFLRu-GFP载体连接构建成pFLRu-U6-shPTEN慢病毒载体。在此基础上,引入外源设计的PTENmRNA,与经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后的pFLRu-U6-shPTEN载体连接,从而产生在同一个载体内兼有人PTEN基因shRNA及其救援cDNA同时表达的RESC慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN。2者均转入到大肠杆菌XL10感受态细胞,制备质粒并用酶切及测序鉴定。分别用pFLRu-U6-shPTEN、pFLRu-U6-rrshPTEN与pCMV-dR8.2ΔR和pCMV-VSV-G质粒共转染293T包装细胞,包装产生2种慢病毒,收集病毒上清,系列稀释法检测病毒悬液的滴度。结果:氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆、酶切鉴定、U6前引物测序鉴定结果显示pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN均为阳性克隆,且2种慢病毒的滴度分别为6.6×105和5.6×105pfu/mL。结论:成功构建出人PTEN基因RNAi及其RESC慢病毒载体。有效地避免了由于脱靶效应所引起的假阳性结果对实验的干扰,为研究PTEN基因功能提供了稳定的转染细胞载体。

PTEN基因敲减及RESC救援后人T淋巴细胞增殖和信号通路的变化

目的构建人PTEN基因RNA干扰(RNAi)及其逃避RNAi策略结构(RESC)救援的慢病毒载体。观察PTEN基因敲减前后及RESC救援后人T淋巴细胞信号通路、细胞增殖和细胞周期的变化,为进一步研究淋巴细胞性白血病的发病机制提供依据。方法利用慢病毒载体系统,构建人PTEN基因RNAi及其RESC救援的慢病毒载体,转染T淋巴细胞,建立PTEN基因敲减及RESC救援的细胞模型T-LC-shPTEN和T-LC-rrshPTEN;分别应用Westernblot法、MTT法和流式细胞术检测PTEN基因敲减前后及RESC救援后PTEN蛋白的表达和AKT通路的活化情况、细胞增殖及细胞周期的变化。结果慢病毒介导的RNAi能有效下调PTEN基因的表达。PTEN基因表达下调后,T淋巴细胞生长受到促进,G0/G1期细胞减少,S期细胞和G2/M期细胞增多,PI3K/AKT通路激活。而RESC救援则能够完全恢复PTEN基因RNAi所造成的现象。结论成功构建了人PTEN基因RNAi及其RESC救援的慢病毒载体。PTEN基因敲减后,通过激活PI3K/AKT通路促进T淋巴细胞生长。