逆转录多聚酶链反应方法研究乳腺癌的微小转移

目的 通过分子生物学与常规免疫组化法比较 ,以寻求更好地检测乳腺癌微小转移的方法。方法 采用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)方法检测 2 6例乳腺癌患者的外周血与骨髓中细胞角蛋白 19(KT19)mRNA的表达 ,并用链酶亲和素 生物素 过氧化物酶复合物 (SABC)免疫组化法检测乳腺癌患者骨髓涂片中上皮膜抗原 (EMA)。结果 2 6例外周血中KT19mRNA阳性 4例(15 4% ) ,骨髓阳性 10例 (38 4% )。免疫组化结果显示 2 6例骨髓中有 7例 (2 6 9% )EMA阳性 ,其KT19mRNA都阳性 ,有 3例 (11 5 % )免疫组化结果阴性而KT19mRNA阳性。结论 RT PCR方法检测KT19mRNA是一种比较敏感的方法 ,免疫组化也是一种比较可靠的检测方法 。

免疫组织化学、荧光原位杂交和逆转录——多聚酶链反应在滑膜肉瘤诊断中的价值

滑膜肉瘤是一种恶性程度很高的软组织肉瘤,起源于具有滑膜分化的间叶细胞,滑膜肉瘤也可发生于某些罕见部位,这经常造成了滑膜肉瘤的误诊。本文对目前用于滑膜肉瘤的3种组织化学病理诊断技术进行综述,比较各种诊断方法的优劣,指导临床实践。

建立实时荧光定量逆转录PCR方法检测非小细胞肺癌棘皮动物微管相关蛋白4-间变淋巴瘤激酶融合基因

目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taqman水解探针。然后,以包含EML4-ALK融合变异V1、V2、V3a和V3b的假病毒颗粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性和特异性。最后,用所建立的方法检测50例非小细胞肺癌临床标本,其中包含3例ALK-荧光原位杂交(FISH)(+)样本。结果在无背景RNA干扰情况下,建立的实时荧光定量逆转录PCR方法检测灵敏度高达10拷贝/!l。在500拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达1%,在5000拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞及血浆RNA为研究对象,均未见非特异性扩增。对50例非小细胞肺癌临床标本进行检测,47例阴性标本检测均为阴性,3例ALK-FISH(+)标本2例检测阳性,1例未检出,未检出原因与标本RNA提取失败有关。结论本研究建立的实时荧光定量逆转录PCR方法是一种快速、简便以及具有高灵敏度和特异性的EML4-ALK融合基因检测方法,值得在临床进一步验证和推广。

胸腔积液脱落细胞端粒酶逆转录酶mRNA检测及其意义

目的:通过检测良、恶性胸腔积液脱落细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达情况,探讨其在良、恶性胸腔积液中的诊断价值。方法:采用逆转录-多聚酶链反应法检测39例恶性胸腔积液、16例良性胸腔积液中hTERT基因的表达情况。结果:恶性胸腔积液中hTERT基因的表达率明显高于良性胸腔积液(P<0.05)。检测hTERT基因表达对恶性胸腔积液的敏感性、特异性和诊断符合率分别为87.18%,81.25%和85.45%。结论:hTERT基因参与了恶性胸腔积液的发生、发展过程。采用RT-PCR法检测胸腔积液中hTERT基因表达有助于临床上良、恶性胸腔积液的鉴别诊断。

逆转录－多聚酶链反应在虫媒病毒研究中的应用

本文重点介绍逆转录－多聚酶链在反应虫媒病毒诊断、鉴别诊断及媒介蚊监测中的应用。

一氧化氮合酶基因在先天性巨结肠中的表达

目的 研究神经型一氧化氮合酶 (n NOS)基因在先天性巨结肠 (HD)不同肠段的表达。方法 分别取 8例先天性巨结肠患者病变段和正常段平滑肌组织 ,经处理后提取总 RNA,应用逆转录多聚酶链反应 (RT- PCR)扩增目的基因和看家基因片段 ,观察病变段和正常段的 n NOS基因的表达 ,并与看家基因 (GAPDH)在病变段和正常段的表达作对比。结果 8例患者正常段 n NOS和 GAPDH均有明显的表达 ,病变段 GAPDH亦有明显的表达而 n NOS均无表达。结论 先天性巨结肠患者病变段抑制性神经递质一氧化氮 (NO)减少的原因可能是 n NOS的 m RNA的减少或缺如 。

汉防已甲素、罗通定及川芎嗪对肿瘤细胞株KBV200多药耐药性逆转作用的研究

目的探讨中药汉防已甲素、罗通定及川芎嗪逆转肿瘤细胞株KBV200多药耐药性作用。方法用四唑盐比色法检测细胞株对药物敏感性,用逆转录多聚酶链反应检测耐药株用药前后肿瘤多药耐药基因的表达。结果在最适逆转浓度下,汉防已甲素(10-6mol/L),罗通定(10-5mol/L)对KBV200耐药性有明显逆转作用,川芎嗪(10-4mol/L)有一定作用,使长春新碱对耐药细胞株KBV200半数致死量由1 122nmol/L分别降至32 nmol/L、35.8nmol/L及541nmol/L。在上述浓度下,3种逆转剂分别与长春新碱(400nmol/L)合用,细胞存活率分别为0.32±0.1、0.29±0.05、0.56±0.1,较对照0.76±0.05有显著差异(P<0.001)。在同样浓度下,3种逆转剂都能使耐药株肿瘤多药耐药基因mRNA表达降低,但与对照比,无显著性差异。结论汉防已甲素、罗通定逆转肿瘤多药耐药性效果好,川芎嗪有一定逆转作用,它们不良反应小,有良好临床应用前景。

心力衰竭病人心肌组织肿瘤坏死因子、诱导型一氧化氮合酶的基因表达与心功能的临床研究

目的 :了解充血性心务衰竭 (CHF)病人心肌组织肿瘤坏死因子 α (THF α)和诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)的基因表达与心功能的关系。方法 :通过手术取材 ,采用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术测定 31例瓣膜病所致不同程序CHF病人 (心力衰竭组 )与 5例正常人 (正常对照组 )心肌组织TNF α和iNOS的mRNA表达。结果 :心力衰竭组与正常对照比较 ,心肌细胞TNF α和iNOS的mRNA表达明显增强 ,且随心功能恶化和心腔扩大 ,TNF α和iNOS的mRNA表达越强。CHF病人中 ,左心室舒张末内径 (LVEDd)≥ 5 5mm者与 <5 5mm者比较 ,左心室射血分数 (LVEF) <0 4 5者与≥ 0 4 5者相比 ,心肌组织TNF α和iNOS的mRNA表达均明显增强 ,P <0 0 5。结论 :CHF病人心肌组织TNF α和iNOS的基因表达与疾病严重程度和左心室扩大呈正相关 ,而与左心室收缩功能呈负相关 ,提示心脏局部的细胞因子在CHF病人的心室重构和心功能恶化等病理过程中起重要作用。

△Np73基因在人非小细胞肺癌中的转录表达及其临床意义

背景和目的ΔNp73是p53基因家族新成员p73的异构体,研究表明ΔNp73因为N末端转录活化区缺失致转录活化功能完全丧失,对p53和全长型p73的转录活化和促凋亡活性有明显的负调节作用。本研究旨在探讨人非小细胞肺癌组织中ΔNp73转录表达及其与患者临床病理特征之间的关系,分析其对肺癌患者预后的意义。方法采用半定量逆转录多聚酶链反应技术(RT-PCR)检测40例非小细胞肺癌癌组织及癌旁肺组织ΔNp73mRNA的表达,结合其临床病理特征,统计分析ΔNp73在肺癌组织中表达的意义。结果51例非小细胞肺癌癌组织中有32例(62.7%)呈ΔNp73mRNA高表达,而在癌旁肺组织中低表达。ΔNp73的表达与肺癌的临床TNM分期有密切关系(P=0.046),但与患者年龄、性别、分化程度和病理学类型无显著相关性。ΔNp73mRNA高表达的患者较低表达的患者术后生存期短,预后差(P<0.001)。结论ΔNp73基因在人非小细胞肺癌癌组织中的转录表达较对应癌旁肺组织明显升高,并与患者临床分期和预后相关。ΔNp73基因的转录表达情况可作为非小细胞肺癌预后判断的参考指标之一。

低密度脂蛋白诱导巨噬细胞髓过氧化物酶活性的研究

目的 :研究低密度脂蛋白 (LDL)与巨噬细胞髓过氧化物酶 (MPO)活性的关系。方法 :LDL诱导培养的小鼠腹水巨噬细胞 ,用MPO催化底物邻联二茴香胺氧化的方法测定MPO活性 ;以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)的方法检测MPO基因的表达 ,借此观察LDL与MPO活性的关系。结果 :LDL可以促进巨噬细胞内及分泌的髓过氧化物酶活性升高 ,但远比细菌脂多糖 (LPS)的作用小 ;氧化型低密度脂蛋白 (OX LDL)没有此作用 ;随着LDL作用时间的延长巨噬细胞内及分泌的髓过氧化物酶活性逐渐升高 ,但随着LDL浓度的增加髓过氧化物酶基因的表达达到最大值后便维持该水平而不再随LDL浓度的变化而变化。结论 :LDL非特异性地诱导巨噬细胞MPO活性升高以及分泌增强 ,加强自身的氧化吸收 ;MPO活性升高的原因可能主要为巨噬细胞内酶活性的激活及分泌增强而非基因表达的增强。

脑损伤后热休克蛋白70及热休克因子Ⅰ基因转录的实验研究

目的 为了解脑损伤后应激基因转录的状况。方法 采用RT PCR对伤后脑组织HSP70 、HSF1mRNA的数量进行测定。结果 在脑损伤 15min后脑干HSP70 、HSF1mRNA水平显著升高 ,在损伤后迅速死亡的致死损伤组的鼠脑中HSP70 、HSF1mRNA水平亦显著升高。结论 应激基因的转录水平在脑损伤后明显提高 ,脑应激蛋白合成增强 ,参与损伤与修复过程。同时由于HSP70 、HSF1mRNA对脑损伤的迅速反应能力 。

罗非昔布对胃癌细胞BGC-823内在耐药的逆转作用

目的探讨罗非昔布和抗癌药5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)和依托泊甙(VP-16)联用抗胃癌细胞株BGC-823的疗效及多药耐药(multidrug resistance gene,MDR)相关基因上的机制。方法0.1μmol/L罗非昔布单用和与不同浓度梯度化疗药5-FU、DDP及VP-16联合应用于胃癌细胞株BGC-823 48 h,MTT法检测各自的抑制率,中效原理评价用药的协同作用;以0.1μmol/L、1.0μmol/L和10μmol/L罗非昔布干预胃癌细胞48 h,RT-PCR观察用药前后多药耐药相关基因变化情况。结果抗癌药与罗非昔布联用同罗非昔布单用或抗癌药单用比较,联合治疗组协同作用明显(均P<0.01)。RT-PCR显示,胃癌细胞株BGC-823多药耐药相关蛋白(multidrug-associatedprotein,MRP)和谷光甘肽-S-转移酶π(glutathione-S-transferasesπ,GST-π)基因表达,无MDR1表达;罗非昔布干预以后,MRP和GST-π均有不同程度的下降(均P<0.05)。结论罗非昔布可协同抗癌药抗胃癌细胞BGC-823。其协同抗癌机制为逆转或部分逆转MDR现象,是较好的化疗增敏剂。

喉癌eIF4E基因的体外转录

目的克隆喉癌eIF4E基因编码区的cDNA序列,并构建其体外转录载体,获得eIF4E基因编码区mRNA,以便进一步的体外实验研究。方法利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法,以喉癌Hep-2细胞mRNA为模板,扩增获得全长eIF4E编码区cDNA,与pMD18T连接作全自动测序,并利用基因重组技术构建eIF4E基因mRNA体外转录载体pGEM-7zf+eIF4E。用内切酶XhoI将含有eIF4E基因mRNA的pGEM-7zf+eIF4E质粒消化成线性,以此为模板体外转录出用[a-32P]UTP标记的靶eIF4E基因编码区mRNA。结果经测序证实获得的eIF4E基因cDNA序列与GeneBank一致,并成功构建了体外转录质粒pGEM-7zf+eIF4E。结论成功构建了体外转录质粒pGEM-7zf+eIF4E,为进一步研究eIF4E的功能奠定了基础。

血小板反应素-1在前列腺癌患者中的表达及意义

目的探讨血小板反应素-1(TSP-1)在前列腺癌患者癌组织及其外周血中的表达及其意义。方法应用免疫组化技术检测TSP-1在前列腺癌组织(前列腺癌组)中的表达;以半定量RT-PCR技术检测TSP-1mRNA在患者外周血中的表达,并与前列腺增生患者(前列腺增生组)进行比较。结果前列腺癌组TSP-1阴性表达6例,弱阳性表达16例,阳性表达4例,增生组TSP-1弱阳性表达12例,阳性表达16例,无阴性表达,前列腺癌组TSP-1表达强度较增生组显著降低(P<0.01);TSP-1mRNA在前列腺癌组织中较前列腺增生组织中表达明显下调(P<0.01)。TSP-1mRNA在前列腺癌组外周血中的表达较增生组明显下调(P<0.01)。结论 TSP-1基因及蛋白表达水平在前列腺癌组织中明显下调,在前列腺癌患者外周血中表达水平明显下调。

复方三根制剂逆转多药耐药的实验研究

[目的]探讨复方三根制剂逆转K562/ADR、K562/VCR细胞株耐药性的机制。[方法]细胞K562、K562/ADR、K562/VCR培养于RPMI鄄1640安全培养液中。MTT法测定两株细胞的抗药性。RT鄄PCR法测定给药处理后24h、48h、72h后两耐药细胞株MDR1表达量。[结果]复方三根制剂和维拉帕米对K562/ADR和K562/VCR不同时段表达MDR1的量有显著差异。[结论]推测复方三根制剂逆转多药耐药机制为在转录水平下调MDR1mRNA,从而降低多药耐药细胞P鄄gp的表达。

细胞型FLICE样抑制蛋白、T-box转录因子在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及意义

目的探讨口腔鳞状细胞癌(OSCC)中细胞型FLICE样抑制蛋白(c FLIP)及T-box转录因子(TBX2)的表达及其临床意义。方法采用免疫组化检测OSCC 57例、口腔黏膜上皮异常增生组织(DOM)38例及正常黏膜组织(NOM)30例中c FLIP、TBX2蛋白表达情况。运用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测OSCC、DOM和NOM中的c FLIP m RNA和TBX2 m RNA表达水平。结果在OSCC、DOM及NOM中,c FLIP的阳性表达率分别为91.23%、84.21%和10.00%;TBX2的阳性表达率分别为87.72%、81.85%和26.67%。c FLIP及TBX2的表达水平与患者的年龄、性别无关,差异无统计学意义(P>0.05),而肿瘤TNM分期以及有无淋巴结转移间差异有统计学意义(P<0.05)。OSCC中c FLIP m RNA及TBX2 m RNA的表达水平明显高于DOM及NOM。c FLIP m RNA及TBX2m RNA的表达水平与患者的年龄、性别无关,差异无统计学意义(P>0.05),而肿瘤TNM分期以及有无淋巴结转移间差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关性分析显示c FLIP及TBX2的表达呈正相关(r=0.768,P<0.05)。结论 c FLIP及TBX2在OSCC中呈高表达,两者可能在OSCC的发生、发展中发挥重要的作用。

核因子-κB在脂多糖诱导大鼠心肌血红素加氧酶-1基因表达中的作用

目的:观察核因子-κB(NF-κB)在脂多糖(LPS)诱导大鼠心肌血红素加氧酶-1(HO-1)表达中的作用,探讨其对内毒素休克(ES)的影响。方法:用生理多导仪监测大鼠静脉注射LPS(8mg/Kg)后12h平均动脉压(MAP)变化;用免疫组化方法检测心肌组织NF-κB p65和HO-1蛋白表达的变化;用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测心肌组织HO-1基因表达的变化。结果:①LPS组MAP较对照组快速持续降低(P<0.01):②LPS可诱导大鼠心肌间质血管内皮细胞和心肌细胞NF-κB阳性表达增强,1/2h和2h表达明显升高,6h和12h逐渐降低;③LPS可诱导大鼠心肌HO-1基因表达上调,2h开始增加,6h达到高峰,12h表达下调;LPS组大鼠心肌间质血管内皮细胞和心肌细胞HO-1蛋白表达在6h明显增强,12h表达减弱。④应用PDTC可明显减轻ES大鼠心肌损伤,并抑制心肌HO-1蛋白和基因表达。结论:LPS活化的心肌NF-κB参与LPS诱导心肌HO-1蛋白和基因高表达的信号转导,可能是导致ES顽固性低血压的机制之一。