Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)A66株的RNA聚合酶基因序列,设计合成了2对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的逆转录套式PCR方法(RT-nested-PCR),采用该方法对DHV-ⅠA66弱毒株和R85952强毒株进行了检测。结果显示,均能扩增到304 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝组织、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。表明,所建立的逆转录套式PCR方法可用于鸭病毒性肝炎(DVH)的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等。

应用逆转录套式PCR检测禽流感病毒核酸研究

选择禽流感病毒NP基因 ,设计并合成一对外引物和一对内引物 ,建立并优化了检测禽流感病毒核酸的逆转录套式PCR法 ,通过实验室检测结果证明 ,该方法具有高度的特异性和敏感性 ,能够用于检测所有的禽流感病毒核酸 ,最低能检测出 0 2pg的AIVRNA ;临床应用结果表明 ,该方法能够应用于规模化鸡场进行禽流感病毒检测 。

应用逆转录套式PCR检测新城疫病毒核酸

选择NDV融合蛋白保守的编码区域 ,设计并合成了一对外引物和一对内引物 ,建立并优化了检测新城疫病毒核酸的逆转录套式PCR法 ,通过检测NDV感染的实验室病料和临床病料。结果表明 ,逆转录套式PCR法最低能鉴别出约 0 .3pg的NDVRNA ,攻毒后第 8天还能从非免疫鸡和SPF鸡泄殖腔拭子中检出NDV ,第 8天非免疫鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为 5 / 10 ,第 8天SPF鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为 6/ 10。对非免疫鸡和SPF鸡的泄殖腔中NDV最佳检出时间均在攻毒后第 5天。逆转录套式PCR方法对临床样品中NDV的最大检出率为 6/ 7。经核酸杂交验证 ,该法具有很高的特异性和敏感性 ,也比较简便快速 ,为从分子水平探讨NDV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。

反义RNA重组逆转录病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

为探求一种快速检测反义RNA重组逆转录病毒效价的新方法,用脂质体介导法将反义RNA重组逆转录病毒载体pLXSA、pLXSB分别转染包装细胞系PA317,经G418筛选,获得数个稳定的产毒细胞克隆,择优挑选7个细胞克隆扩增培养,收集细胞上清,用异硫氰酸胍-酚一步法提取病毒RNA,进行逆转录套式PCR,检测细胞上清中的反义RNA重组逆转录病毒效价,同时用传统方法(小鼠成纤维放大法)进行测定。2种方法检测结果的比较表明,逆转录套式PCR法的特异性和敏感性均高于小鼠成纤维放大法,是一种敏感性高、特异性强、操作简便、快速的检测逆转录病毒效价的新方法。

B亚型禽偏肺病毒逆转录套式PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank发布的B亚型禽偏肺病毒Fusion(F)基因的保守序列设计2对引物,建立了一种适用于B亚型禽偏肺病毒的逆转录套式PCR检测方法。采用该方法对B亚型禽偏肺病毒山东分离株进行检测,可以特异性地扩增出415bp的目的片段。此方法具有高度特异性和敏感性,以H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒作为模板进行扩增,结果均为阴性。经检测,该方法第1次PCR扩增的敏感性为107copies/μL,第2次扩增的敏感性为102copies/μL,第2次扩增敏感性比第1次高105倍。应用本方法对采自山东省不同地区的64份可疑临床病料进行检测,最终从64份疑似病料中检测出37份为阳性。结果表明,所建立的套式PCR检测方法具有特异、敏感、实用等优点,为B亚型禽偏肺病毒的快速诊断以及深入研究奠定了基础。

猕猴逆转录病毒多重套式PCR检测方法的建立

分别针对编码STLV-1和SRV/D-1两种逆转录病毒膜蛋白的env基因进行引物设计,通过优化、调整PCR条件,建立一种能同时检测猕猴STLV-1和SRV/D-1两种逆转录病毒的多重PCR方法,用于猕猴种群逆转录病毒的常规监测。结果显示多重套式PCR产物片段大小与预期结果一致,进一步测序证实为目的产物,说明建立的多重套式PCR方法能同时检测出猕猴体内可能存在的STLV-1和SRV/D-1两种逆转录病毒。这种方法具有灵敏度高、特异性强、省时、试剂用量少和检测费用低等优点,因此可以作为一种新方法用于猕猴种群逆转录病毒的定性监测。

风疹病毒气溶胶的逆转录－半套式PCR检测

将已知浓度的风疹病毒液通过ＴＫ发生器进行气溶胶发生于气溶胶转鼓中，搅匀后用ＡＧＩ－１０和Ｃａｓｅｌｌａ采样器进行气溶胶采样，采样样品以不同浓度稀释后分别进行ＲＴ－ＳＮ－ＰＣＲ和细胞培养。敏感性试验结果表明１００ＴＣＩＤ（５０）的ＲＶ病毒仍可被ＲＴ－ＳＮ－ＰＣＲ检测到，扩增片段为２９３ｈＰ，经ＨｉｎｃⅡ酶切成１２１和１７２ｈＰ的酶切片段与理论设计吻合。相应的Ｖｅｒｏ细胞培养结果均为阴性。通过气溶胶耐喷和耐压试验证明ＲＶ在空气采样过程中因高压冲击衰亡。ＰＣＲ检测微生物核酸，可不过多地考虑其生物衰亡，只要靶基因存在即有检测的可能性。

逆转录套式ＰＣＲ检测丙型肝炎病毒感染者ＨＣＶ ＲＮＡ

目的 探讨人血清和外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ与血清ＩｇＧ和ＩｇＭ抗体联合检测对丙型肝炎的诊断价值。方法对以ＥＬＩＳＡ方法检测所得的４６例ＨＣＶ—ＩｇＧ阳性的标本用逆转录套式聚合酶锭反应（ＲＴ—ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ）检测血清和ＰＢＭＣ中ＨＣＶＲＮＡ，同时用ＥＬＩＳＡ方法检测血清中ＨＣＶ—ＩｇＭ。结果血清中有１７例ＨＣＶ ＲＮＡ阳性和６例ＨＣＶ—ＩｇＭ阳性，而ＰＢＭＣ中有１９例ＨＣＶＲＮＡ阳性。结论血清中ＨＣＶ—ＩｇＭ可作为丙型肝炎的初筛诊断，ＨＣＶ—ＩｇＭ可作为ＨＣＶ近期感染的指标，但二者均不能准确反映病毒在体内的存在情况，而套式ＰＣＲ方法检测ＨＣＶＲＮＡ可直接反映ＨＣＶ在体内的活动情况，其中ＰＢＭＣ中检测ＨＣＶＲＮＡ的阳性率高于血清，提示ＨＣＶ可能在ＰＢＭＣ中潜伏乃至复制。

逆转录-套式PCR鉴定福建省登革Ⅰ型病毒

目的检测急性感染者血清中的登革病毒,并判定其型别。方法从血清中提取病毒RNA,使用通用引物和型特异性引物,用逆转录-套式PCR方法扩增登革病毒特异性核酸片段,电泳后观察判定型别。同时还将扩增产物进行测序分析。结果用通用引物扩增5份标本,均出现511bp扩增带,在型特异性引物的扩增下均出现482bp的扩增带,初步判断为DVⅠ病毒。经测序分析进一步确定为DVⅠ病毒。结论运用此方法证实2004年福建省登革热流行系DVⅠ病毒引起。

逆转录-套式PCR方法鉴定福建省登革热分离株型别的研究

目的 应用分子生物学手段鉴别福建省登革热分离株的型别。方法 病毒培养上清经浓缩后离心沉淀 ,提取病毒ＲＮＡ ,行ＲＴ -ＰＣＲ ,再用型特异性引物扩增出特异性片段 ,电泳观察判断其型别。结果 从早期病人血液中分离的 3株和从白纹伊蚊中分离的 1株病毒经扩增后其产物均为登革热 2型特异性条带。结论 福建省 4株分离株均为登革热 2型病毒。

检测感染鸡体内传染性支气管炎病毒反转录套式PCR方法的建立

根据先前克隆并测定的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列,设计了2对引物,通过对IBV各毒株(M41,H52,H120,Aust-T以及野毒株等)攻毒鸡的组织中的IBV进行反转录套式PCR检测,结果均为阳性,而对鸡的其他传染病病毒(IBDV,AIV,NDV)进行检测,结果均为阴性。结果表明所建立的反转录套式PCR方法可用于感染鸡体内IBV各血清型毒株的检测。

套式PCR检测斑节对虾白斑症病毒(WSSV)

解剖患白斑症斑节对虾的鳃组织 ,制备成不同稀释倍数的模板 ,对其进行白斑症病毒 (WSSV)的 PCR扩增 ,结果显示所建立的套式 PCR的灵敏度大约为一步 PCR的 10 4 倍 ;对感染病毒后不同时期的斑节对虾进行 PCR检测 ,发现感染早期经一步 PCR检测为 WSSV阴性的样品 ,套式 PCR的检测结果为阳性 ;对发病虾塘中的几种甲壳类动物进行 PCR检测 ,发现经一步 PCR检测为阴性的长臂虾、秉氏厚蟹和褶痕相手蟹等宿主 ,套式 PCR的检测结果为阳性。表明所建立的 WSSV套式 PCR检测法较普通的一步

RT套式PCR检测血浆HCV RNA及与抗HCV检测的比较

应用微量血清热变性法提取核酸 ,逆转录套式聚合酶链反应 (RT nestPCR)检测血浆HCVRNA ,并与抗HCVELISA检测结果比较 ,对HCVRNA阳性标本进行HGVRNA的筛查。结果在 32例抗HCV阳性和 2 0例抗HCV阴性血浆中 ,HCVRNA分别检出 18例和 2例 ,总符合率为 70 % ,2 0例HCVRNA阳性者中有 2例合并感染HBV ,1例合并感染HGV。

猪圆环病毒2型套式PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的猪圆环病毒 2型 (PCV2 )的全基因组序列 ,设计了 2对引物 ,建立了检测PCV2的套式PCR方法。对该方法用序列分析、酶切等方法进行了鉴定。同时用该套式PCR方法对华南地区 2 87个猪场的 15 6 0份样品进行了检测 ,结果 ,983份为PCV2阳性 ,阳性率为6 3%。

套式PCR检测奶牛粪便中隐孢子虫

为了检测样品中的微量隐孢子虫 ,从含有不同数量隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中 ,直接提取DNA用作初始PCR(Initial PCR)模板 ,以稀释的初始PCR的产物为模板进行套式PCR(Nested PCR) ,用两对人工合成寡核苷酸分别作为两PCR的引物 ,扩增大小分别为 540pb、2 58pb的特异片段。PCR产物经电泳鉴定 ,可从阳性粪便标本DNA抽提物中扩增出目的片段 ,而阴性对照不能扩增目的片段 ;初始PCR、套式PCR的敏感小生最低可分别检测到含卵囊1 0 0、5个 /g粪便。初步应用结果表明某奶牛场的奶牛自然感染率为 1 6 4%。试验表明套式PCR的敏感性比普通PCR约高 1 0 0倍 。

套式PCR直接检测印度腥黑穗病菌冬孢子

用印度腥黑穗病菌冬孢子制备模板DNA ,利用印腥特异性引物T3 /T6,T3 /T4和套式PCR(nestPCR)扩增技术直接检测印腥冬孢子 ,检测的灵敏度可达 1个冬孢子。检测时间缩短为 1天。这种简单、快速、灵敏、实用和准确的PCR检测技术适用于口岸印腥检疫的需要 ,解决了常规PCR检测中DNA制备需要萌发冬孢子和检测时间长的难题。

半套式PCR检测军团菌方法的建立及应用

目的 建立检测军团菌的分子生物学方法。方法 采用常规PCR对军团菌属 16SrRNA编码区域和嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强子 (mip)基因编码区域进行扩增 ,同时采用半套式PCR对常规PCR的扩增结果进行确证。结果 采用常规PCR对军团菌属 16SrRNA编码区域进行扩增 ,5种军团菌 (包括 3种嗜肺军团菌 )扩增产物均可见6 5 4bp的特异性扩增带 ,非军团菌菌株PCR结果为阴性 ,采用半套式PCR对常规PCR扩增产物进行验证 ,扩增产物均可见 4 30bp扩增带 ;同时采用常规PCR对嗜肺军团菌mip基因编码区域进行扩增 ,3种嗜肺军团菌扩增产物均可见6 4 9bp扩增带 ,非嗜肺军团菌菌株均为阴性 ,采用半套式PCR对常规PCR扩增产物进行验证 ,3种嗜肺军团菌扩增产物均可见 399bp扩增带。敏感性为 10CFU/ml。并且应用此方法成功检测环境水样中分离的疑似军团菌菌株。结论 半套式PCR经济、简便、快速、敏感、特异 ,为军团菌的早期检测、环境监测。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的套式PCR检测

根据猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)apxⅣA毒素基因的序列,设计了两对特异性引物P1/P4和P6/P8,建立了检测APP全部15个血清型的套式PCR方法。对APP的15个国际标准血清型和国内的APP菌株进行了PCR检测,都能得到223bp的特异性扩增产物;检测的灵敏度可达1.3CFU,最低检出DNA浓度为9fg。

鸡贫血病病毒套式PCR检测方法的建立及应用

鸡贫血病病毒不仅引起鸡的传染性贫血 ,而且也是引起鸡免疫抑制病的主要病原。本研究首次在国内建立了鸡贫血病病毒的套式PCR检测方法。试验证明此方法具有高度的特异性和敏感性 ,以鸡马立克氏病毒、鸡网状内皮组织增生病毒、鸡传染性法氏囊病毒、正常MDCC_MSB1细胞DNA作为模板扩增时均未出现可见带 ,在检测鸡的各种组织病料时均未出现假阳性结果 ,该法比一次性PCR的敏感性高约 1 0 0 0倍 ,能检测到约一个拷贝的鸡贫血病病毒DNA ,而一次性PCR只能检测到3.6× 1 0 3 个拷贝。此方法已成功地应用于临床试验。对于鸡贫血病毒的许多鸡胚分离物和细胞分离物 ,一次性PCR不能扩增出可见电泳条带 ,而套式PCR都能扩增出特异的DNA片段 ,从而说明 ,套式PCR的敏感性大大高于一次性PCR 。