绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。

鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

低温弱光胁迫下茄子幼苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价

为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差异情况,并运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种计算方法评价茄子20个候选内参基因在低温、弱光、低温弱光叶片样品中的表达稳定性。结果表明:茄子20个候选内参基因荧光定量引物扩增效率(E)数值在96.8%~117.6%,相关系数(R^(2))介于0.9688~0.9999,扩增效率良好,扩增反应具有高度的专一性,引物能特异性扩增,特异性好,均为单峰,样品间扩增曲线重复性强,可用于qRT-PCR扩增。茄子20个候选内参基因C_(T)值表达丰度分析,发现茄子20个候选内参基因平均CT值在19.76~31.20。3种计算方法的综合评价分析结果显示,TBP基因在所有样本中为最稳定的内参基因。研究可为茄子低温、弱光和低温弱光胁迫下基因特异性表达研究提供了合适的内参基因。

在生物科学综合实验引入实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术是核酸定量分析的重要方法,是分子生物学领域的前沿技术,广泛应用于基础生物学研究、肿瘤诊断、病毒检测和食品检测等领域。在“生物科学综合实验”课程中引入此项技术,丰富了课程内容,也提高了课程的挑战度。经过教学实践,取得了良好的效果。学生不仅掌握了扎实的实践技能和前沿的科研方法,还提高了数据分析与处理的能力。

逆转录实时荧光定量PCR检测p73 mRNA在结肠癌的表达

目的:建立一种实时定量PCR方法检测p73mRNA的表达水平,探讨其与结肠癌发生、发展的可能关系。方法:采用SYBRGreenⅠ逆转录实时荧光定量PCR检测39例结肠癌组织和其癌旁组织中p73mRNA的表达。结果:p73基因在结肠癌肿瘤组织的表达水平高于其在癌旁组织的表达(P<0.01);表达水平与肿瘤的恶性程度、分化及淋巴结转移显著相关(P<0.05)。结论:p73的高表达可能与结肠癌的发生、发展及预后有联系。

食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌实时荧光PCR检测的研究

目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的核酸检测方法。方法:根据16S~23S rRNA基因片段序列,利用Oligo7设计TaqMan探针及引物,并验证实时荧光PCR检测方法的特异性和灵敏性。结果:用实时荧光PCR检测方法检测15株标准菌株,只有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌呈阳性,验证了此方法具有良好的特异性。灵敏度实验中得出菌液灵敏度为5.8×10~2 CFU·mL^(-1),DNA灵敏度为7.2×10^(-4) ng·μL^(-1)。结论:建立的实时荧光PCR检测方法有良好的特异性和灵敏度,该方法可用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测,具有较好的应用价值。

实时荧光定量RT-PCR检测结直肠癌中外周血端粒酶逆转录酶mRNA的表达及其临床意义

目的:建立外周血端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达量检测的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)系统,检测结直肠癌患者hTERT mRNA的表达并探讨其对结直肠癌微转移的诊断价值.方法:用实时荧光定量RT-PCR技术检测53例结直肠癌患者和21名健康人的外周血标本hTERT mRNA表达情况,分析其表达与肿瘤临床病理特征的关系并应用接受者操作特征曲线(ROC曲线)分析hTERT mRNA检测对结直肠癌的诊断价值.结果:结直肠癌组外周血hTERT mRNA表达水平显著高于正常对照组(t'=7.953,P<0.05),其表达与肿瘤淋巴结转移、血行转移和TNM分期相关(t'/t=2.334,2.149,2.460,均P<0.05).hTERT mRNA诊断结直肠癌的ROC曲线下面积0.91,诊断界值为Ct≤32.结论:应用实时荧光定量RT-PCR技术克服了传统PCR只能定性检测而不能定量检测的缺点;外周血hTERT mRNA可作为诊断结直肠癌微转移的标记物.

建立实时荧光定量逆转录PCR方法检测非小细胞肺癌棘皮动物微管相关蛋白4-间变淋巴瘤激酶融合基因

目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taqman水解探针。然后,以包含EML4-ALK融合变异V1、V2、V3a和V3b的假病毒颗粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性和特异性。最后,用所建立的方法检测50例非小细胞肺癌临床标本,其中包含3例ALK-荧光原位杂交(FISH)(+)样本。结果在无背景RNA干扰情况下,建立的实时荧光定量逆转录PCR方法检测灵敏度高达10拷贝/!l。在500拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达1%,在5000拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞及血浆RNA为研究对象,均未见非特异性扩增。对50例非小细胞肺癌临床标本进行检测,47例阴性标本检测均为阴性,3例ALK-FISH(+)标本2例检测阳性,1例未检出,未检出原因与标本RNA提取失败有关。结论本研究建立的实时荧光定量逆转录PCR方法是一种快速、简便以及具有高灵敏度和特异性的EML4-ALK融合基因检测方法,值得在临床进一步验证和推广。

荧光实时逆转录PCR定量研究进展

荧光实时逆转录PCR广泛应用于稳态mRNA水平的定量 ,并且它已经成为基础研究、分子医学和生物技术的一种必不可少的实验工具。用此技术定量具有范围宽、敏感性高、精确度高 ,无PCR后处理步骤 ,避免了交叉污染 ,且产出率高 ,可以进行多重检测等特点。然而要成功地应用该技术并不是一件容易的事。现对方法学建立、扩增效率以及标准化等方面作一综述。

槟榔黄化植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。

实时荧光定量PCR检测端粒酶逆转录酶mRNA在急性白血病中的表达

目的研究人类端粒酶转录酶（hTERT）在急性白血病的表达和意义。方法应用实时定量PCR（Real-time PCR）技术检测30例急性白血病骨髓单个核细胞及25例正常人骨髓单个核细胞中hTERT mRNA的表达水平，分析其表达水平与急性白血病恶性程度的关系。结果hTERT在急性白血病细胞中的中位表达量为0．00244（0～0．0320），明显高于正常人骨髓单个援细胞中hTERT的中位表达量2．79×10^-4（0～0．0078）（P〈0．001）。但在ANLL和ALL细胞中对比表达无明显差异（P=0．742）。结论在急性白血病中hTERT明显高于正常对照，hTERT是急性白血病诊断的特异性指标之一。

实时荧光定量PCR检测鸭源鹅细小病毒方法的建立与应用

为建立一种快速且准确检测鸭源鹅细小病毒(D-GPV)的实时荧光定量PCR方法,本研究通过分析D-GPV基因序列的保守区设计并合成一对特异性引物,构建携带NS1基因的重组质粒作为标准品,绘制实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品的检测。结果显示,该方法标准曲线的的线性关系良好,相关系数为0.999;灵敏度高,检测底限为10拷贝;特异性与重复性好,与其他病毒无交叉反应,批间和批内变异系数均低于1%。该方法对人工感染D-GPV鸭泄殖腔拭子和咽拭子样品的检测结果显示,鸭在攻毒后第1 d即可以通过口腔和泄殖腔向外排毒,排毒量在第3 d达到高峰,排毒持续期可达到42 d。本研究所建立的实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性和稳定性好,可用于临床样品中的D-GPV检测。

鸽腺病毒通用型实时荧光PCR检测方法的建立与应用

鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAdV)是影响鸽产业健康发展的重要病原之一。为实现PiAdV的高通量快速检测,根据GeneBank登录的PiAdV-A种和PiAdV-B种病毒pⅧ基因序列的共同保守区域设计特异性检测引物和探针,经反应条件优化,建立了一种PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示:该方法的最佳探针浓度为0.2μmol/L,与鸽群其他常见病毒无交叉反应,对PiAdV的最低检测限为56.9 copies/μL,比常规PCR敏感性高100倍,组内和组间重复变异系数均小于1.8%。利用该方法和常规PCR方法对20份疑似PiAdV感染样品进行检测,发现PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法的病毒阳性检出率高于常规PCR方法。结果表明,本研究建立的PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法特异性强、敏感性高、可靠性好,可用于PiAdV感染的临床检测及流行病学调查。

PRRSV、CSFV、PRV和PCV2四重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的四重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,针对PRRSV的ORF2基因、CSFV的5′UTR基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因设计了引物及Taq Man探针,并进行反应体系优化,敏感性、特异性验证,建立了同时检测上述4种病原的四重实时荧光定量PCR。结果显示,所建立的四重荧光PCR扩增效率(E)、相关系数(R^(2))及曲线斜率均在正常范围内,检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2 E值、R^(2)、斜率分别为92.9%、0.998、-3.504,90.7%、0.998、-3.566,94.3%、0.996、-3.466,94.2%、0.997及-3.470。PRRSV、CSFV、PRV、PCV2重组质粒最低检出限分别达到10^(2)、10^(2)、10^(2)、10^(3) copies/μL;四重qPCR反应体系中的多条引物间不发生交叉反应,经评价该方法特异性良好;批内和批间重复性试验结果显示,变异系数(CV)均在1%以下,具有良好的重复性。分别使用该方法和相应的国标荧光定量检测法对采集的298份临床样品进行检测对比,两种方法检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2阳性符合率分别为96.08%、96.38%、100%、94.95%,均在94%以上。结果表明,建立的检测方法方便、灵敏、高效、特异性强,适用于猪呼吸道疾病病原学、流行病学研究以及临床病例的诊断,并为猪呼吸道疾病的预防和控制提供技术支撑。

水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10^(1) copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^(-2) pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。

氟胁迫条件下茶树叶部实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证

为了筛选氟胁迫条件下茶树(Camellia sinensis)叶部用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析的内参基因,以课题组前期筛选的低氟茶树品种福鼎大白茶和高氟茶树品种金观音为试验材料,利用qRT-PCR技术结合geNorm、NormFinder和BestKeeper软件,分析氟胁迫条件下(0.42 mmol·L^(-1)NaF)8个候选内参基因(CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC)在茶树不同叶位(新梢和老叶)、不同胁迫时间(0、1、3、7 d)的表达稳定性。结果显示,在氟胁迫条件下,茶树新梢中最优内参基因组合是CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN,老叶中最优内参基因组合是CsPP2A和CsUBC。利用筛选得到的最优内参基因组合分析氟输出蛋白基因(CsFEX)的表达情况,发现CsFEX在两个茶树品种的新梢和老叶中的表达趋势一致,说明筛选的内参组合可用于氟胁迫条件下茶树新梢和老叶中目的基因的检测。

鸭坦布苏病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性、敏感性和重复性,并使用该方法对临床样本进行检测。结果显示,所建立的标准曲线相关系数为0.999 5,有良好的线性关系;该方法可特异检测DTMUV;对标准质粒的最低检测限为2.72×10^(2) copies/μL,是普通PCR的100倍;CT值组内变异系数为0.97%~1.32%,组间变异系数为1.24%~1.79%;人工感染DTMUV的20份鸭胚成纤维细胞样本以及12份人工攻毒2 d的雏鸭脾脏组织样本和12份泄殖腔棉拭子样本阳性率为100%(44/44);疑似感染的12份活鸭泄殖腔棉拭子阳性率为25.00%(3/12),14份病死鸭脾脏组织样本阳性率为28.57%(4/14)。结果表明,本试验建立的TaqMan探针qPCR方法有良好的敏感性、准确性和重复性,能特异检测DTMUV,适用于临床快速检测,为DTMUV的分子流行病学调查和临床疾病诊断提供了技术支撑。

荞麦源性成分实时荧光PCR检测方法的建立

为检测荞麦类食品及原料中的荞麦源性成分,根据荞麦品种DW-1核酸序列信息(KY945277.1)设计了荞麦品种特异性引物;以苦荞和甜荞品种基因组为模板,建立了荞麦源性成分的实时荧光PCR(qPCR)的检测方法,并对购自市场的多个粮食产品进行检测,检测结果与商品标识相符方法特异性强、灵敏度高,为食品中荞麦源性成分的检测提供了新思路。

猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。

采用实时荧光定量PCR法检测大曲中的3种高温放线菌

建立实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)方法对大曲中3种高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris、T.intermedius和T.daqus)进行特异性定量检测。根据T.vulgaris、T.intermedius、T.daqus全基因组中特异性单拷贝核心基因recA、mdH、gyrA为参考序列分别设计了一对可扩增278、233、291 bp片段的引物;经特异性、有效性、准确性实验显示,在常见的13种白酒酿造微生物中,引物TV、TI、TD分别可特异性检测T.vulgaris、T.intermedius、T.daqus,检测范围为2.82~8.82 lg copies/μL,加标回收率95%~105%。进一步对大曲发酵过程样品检测,结果显示,T.vulgaris含量在呈现波动趋势,在第5天达到最高,为(6.06±0.02)lg copies/g;T.intermedius含量呈现先上升后下降的趋势,在第7天达到最高,为(6.33±0.13)lg copies/g;T.daqus含量在0~12 d呈现波动趋势,在12~14 d下降,随后一直上升,发酵结束时含量最高,为(7.62±0.02)lg copies/g。该研究建立的RT-qPCR方法可对大曲发酵过程中3种高温放线菌进行特异性鉴定和快速定量,为进一步监测高温放线菌在白酒酿造过程中的功能提供了方法。