微滴式数字聚合酶链式反应在血流感染快速诊断中的性能评价及应用

目的使用临床菌株和标准菌株验证微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)试剂检测性能,并评估ddPCR技术临床应用的有效性和实用性。方法使用临床菌株和标准菌株验证ddPCR试剂盒符合率、特异度、精密度、最低检出限等。收集74例疑似血流感染患者的血液样本,同时采用ddPCR和血培养2种方法测定患者血液标本的病原体。结果ddPCR血流感染病原体检测的平均检测时间为3.5 h,能够同时检测十几种常见病原体,ddPCR血流感染病原体检测试剂盒的符合率、特异度、精密度、最低检测限均满足临床要求。疑似血流感染的74例患者中,采用ddPCR方法检测的阳性率为64.86%,采用血培养检测的阳性率为40.54%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ddPCR可快速﹑批量﹑高效地检测血流感染常见病原体,检测性能可以满足临床需要,血培养联合ddPCR技术检测血流感染有利于临床血流感染患者的早期快速诊断。

微滴式数字聚合酶链式反应精准定量检测羊肉中掺杂猪肉

以羊和猪的单拷贝持家基因DNA复制蛋白A1为靶基因设计合成了适用于微滴式数字聚合酶链式反应的特异性引物和探针,通过理论推导获得了单位质量两种肉基因拷贝数之比的固定值,并进行了验证,据此将样品中羊肉和猪肉的拷贝数转换为相对质量分数,从而建立了羊肉中掺杂猪肉的精准定量检测方法。该方法可以很好地应用于羊肉中掺杂猪肉的含量检测,猪肉的最低定量限为1%,在5%~80%范围内绝对误差小于±1.30%,相对误差小于±10%,定量结果准确、重复性高,可以为肉类掺假的监管工作提供有力的技术参考。

液滴微流控系统在数字聚合酶链式反应中的应用研究进展

数字聚合酶链式反应（ PCR）技术近年来发展迅速。与以实时荧光定量PCR为代表的传统PCR技术相比，数字PCR技术显著提高了定量分析的精确度和灵敏度。数字PCR的快速发展与近年来微流控技术在数字PCR技术中的广泛应用有着密切的联系。早期的研究和商业化产品使用的是大规模集成流路微流控芯片，加工过程复杂且价格高昂。近年来，液滴微流控芯片被应用到数字PCR技术中，它可以在短时间内产生10^2-10^7个微液滴，每一个微液滴都是最多只含有一个目的基因片段的PCR反应器。 PCR扩增后，通过对单个微液滴的观察计数，就可以获得绝对定量的分析数据。本文综述了不同种类的液滴微流控系统在数字PCR技术中的应用，以及液滴数字PCR微流控芯片在生物、医药、环境等领域的应用。

微滴式数字聚合酶链式反应在食品安全检测领域的应用

微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)是一种新型核酸扩增技术,可对DNA或RNA分子采用绝对定量的方式进行分析。其结果具有更高的精准度、准确性和灵敏度,大大提升了数字PCR技术的可扩展性与实用性,促进了现代分子生物学在精准定量检测方面的发展和应用。本文重点论述了ddPCR法的技术原理、优势以及在食源性致病微生物定量检测、转基因成分分析、食品源性成分检测等食品安全检测领域的应用研究进展情况。

应用微滴式数字聚合酶链式反应定量检测牛肉制品中的猪源性成分

参照GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光聚合酶链式反应法》,以牛的生长激素(growth hormone,GH)基因和猪的朊蛋白(prion protein,PRNP)基因2种核基因为靶基因合成特异性引物和探针。理论推导单位质量牛肉的GH基因与猪肉PRNP基因拷贝数之比为一固定值,通过微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)方法对该固定值进行检测和验证,并以该固定值对牛肉/猪肉人工混合样本和市售牛肉制品中的猪肉成分进行定量检测。结果表明:该方法具有良好的准确性及可重复性;牛肉中掺杂猪肉质量分数在5%～99%范围内时,检测结果绝对误差小于1.28%,变异系数小于6.5%,猪肉成分的回收率为99.09%～102.80%;20份牛肉制品中,4份检出猪肉成分,其中3份的相对含量为29.19%～98.15%,1份为0.12%(低于本方法检出限5%)。因此,dd PCR方法可以较好地应用于牛肉制品中掺杂猪肉成分的定量检测。

微滴式数字聚合酶链式反应对香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量分析

为实现肉制品中动物源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR),以鸡的转化生长因子β-3基因、猪的朊蛋白基因和牛的生长激素基因为靶基因,建立香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量检测方法。结果表明:所建立ddPCR方法特异性强,能特异性检测相应的鸡、猪、牛源性成分;根据肉粉质量(mg)与DNA质量浓度(ng/μL)、DNA质量浓度(ng/μL)与基因拷贝数浓度(copies/μL)之间的线性关系,得到鸡肉粉、猪肉粉和牛肉粉质量(x1)与基因拷贝数浓度(y 2)之间的关系式为:鸡:x1=n×y2/273.946-n/886.557+0.216;猪:x1=n×y2/64.950+n/60.644+0.215;牛:x1=n×y2/62.839+n/12.646+1.218(n为稀释倍数);基于建立的ddPCR方法对64份市售不同种类香肠样品进行检测,在1份原料标识仅为“猪肉”的香肠中检出鸡源性成分含量为18.68%。本研究建立的ddPCR方法能够实现香肠中鸡、猪、牛源性成分的准确定量检测,并可以此判断“蓄意掺假”或“无意带入”。

基于微滴式数字聚合酶链式反应技术的肉制品中鸭源性成分的定量检测

为实现肉制品中鸭源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)技术,以鸭生长激素(growth hormone,GH)基因为靶基因,建立肉制品中鸭源性成分的定量检测方法。结果表明:所建立的ddPCR方法能特异性检测鸭源性成分,灵敏性为11.1 copies/μL;根据鸭肉粉质量(mg)与DNA质量浓度(ng/μL)、DNA质量浓度(ng/μL)与鸭GH基因拷贝数浓度(copies/μL)之间的线性关系,建立鸭肉粉质量(x)与鸭GH基因拷贝数浓度(y)之间的关系式为x=(n×y)/725.046-n/1317.06+0.153;模拟混合样本中鸭肉粉质量分数5%-100%时,鸭源性成分检测的绝对误差均小于±1.52%,变异系数均小于10.38%,回收率为98.35%~125.32%;在88份商品化肉制品中,11份肉制品中检出鸭源性成分,检出率为12.5%,且鸭源性成分含量为18.6%~87.4%。本研究所建立的鸭源性成分ddPCR方法有较好的准确性和较强的适用性,能够应用于肉制品中鸭源性成分的定量检测。

冬虫夏草微滴式数字聚合酶链式反应定量检测方法的建立及应用

目的建立一种定量检测冬虫夏草菌的微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)检测方法,探讨其定量检测冬虫夏草的可行性。方法使用冬虫夏草菌特异性引物和探针建立ddPCR检测方法,对冬虫夏草及其常见伪品进行鉴别,对其特异性和自制混伪品进行检测和评估,并采用该方法对市场流通的冬虫夏草产品中的冬虫夏草菌成分进行检测。结果ddPCR检测方法对冬虫夏草菌具有良好的检测特异性,且在掺伪0%~70%范围内定量检测的准确性高;此外,对冬虫夏草及其制剂市售样品的检测结果显示,该方法可用于冬虫夏草的定量检测。结论ddPCR检测方法可成功检测市售冬虫夏草产品中的冬虫夏草菌成分,具有市场应用价值,可为含冬虫夏草成分的保健食品和药品提供定量和鉴伪检测依据。

一种用于核酸高灵敏检测的液滴式数字聚合酶链式反应芯片

为了实现对核酸的高灵敏度检测,构建了一种新型的液滴式数字聚合酶链式反应(dd PCR)芯片.该芯片由产生液滴的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模块和储存液滴的玻璃腔室构成.实验结果表明,该芯片可以在25 min内产生2×106个直径为20μm的微液滴(体积4.187 p L).利用该芯片定量检测了表皮生长因子受体(EGFR)基因第19号外显子,在DNA浓度为106~101copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R2=0.9998);在浓度为106copies/μL的19号外显子野生型DNA中检测105~100copies/μL的突变型DNA,其检测敏感度可达到0.0001%.该方法在同一芯片上实现了液滴产生、核酸扩增和荧光信号读取的功能,在核酸绝对定量及痕量突变基因的检测中具有潜在应用前景.

微滴式数字聚合酶链反应在传染病检测中的应用

1999年,VOGELSTEIN等[1]正式提出了数字聚合酶链反应(dPCR)的概念。目前,dPCR主要分为3类:微反应室/孔板数字PCR、微流控芯片数字PCR和微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)[1-3]。其中,ddPCR是利用微滴发生器将反应体系一次性生成单分子水平的油包水微滴,再独立地进行循环扩增反应,扩增结束后分别对每个反应单元的荧光信号进行采集,有荧光信号的标记为“1”,无荧光信号的标记为“0”,使用泊松概率分布函数进行计算,最终得出反应体系最初的DNA拷贝量。ddPCR与实时荧光定量PCR(qPCR)采用相同的引物及探针,通过有限稀释法和泊松分布原理直接定量分析,计算出DNA水平。

微滴式数字聚合酶链反应在病原体检测中的研究进展

聚合酶链反应是一种分子生物学技术,用于使某些脱氧核糖核酸(DNA)片段扩增,它是一种常见且不可或缺的技术,已应用于许多领域,特别是在临床实验室中。第三代聚合酶链反应,微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR),是常规聚合酶链反应方法的生物技术改进,可用于直接定量和克隆扩增DNA。ddPCR现在广泛用于低丰度核酸检测,可用于感染性疾病的诊断。该文介绍了ddPCR检测手段的发展及原理,总结了其在病毒性疾病、细菌性疾病和真菌性疾病临床诊断中的潜在优势:ddPCR对低丰度病原体的检测更灵敏、准确、可重复,可能在未来临床应用中是比定量聚合酶链反应更好的选择。

微滴式数字聚合酶链反应在重症感染病原学诊断中的应用进展

重症感染是导致人类死亡的主要病因之一,尤其对于重症监护病房患者,传统的病原微生物检测手段存在灵敏度和特异度低、耗时长等问题,严重影响脓毒症患者病原学早期快速诊断,导致其病死率增加。近年,随着分子诊断技术在重症感染疾病中的广泛应用,病原学的诊断效率及准确性均显著提高。其中,微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)凭借高灵敏度、高特异度、绝对定量等优势,在病原菌载量动态监测和抗生素疗效评估中具有巨大潜力。因此,ddPCR技术或可提高重症患者的诊断率,改善其预后。

基于微滴式数字PCR技术检测树莓制品的定量分析方法

为了检验树莓制品中是否掺杂其他成分,建立了微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet Digital PCR,ddPCR)技术定量检测树莓成分的检验方法。结果表明,实验建立的树莓掺假模型的检测结果准确,为检测市售树莓制品中是否掺假提供了一种新的、更加精确的定量手段。

微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中金黄色葡萄球菌

基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)技术,建立发酵乳中金黄色葡萄球菌定量检测方法。以金黄色葡萄球菌nuc基因为目的片段设计特异性的引物和探针,优化反应体系,通过活菌提取和ddPCR方法对靶标基因的检测特异性和灵敏度进行实验,并对定量结果进行分析。本研究建立了发酵乳中ddPCR技术定量检测金黄色葡萄球菌的方法,检测特异性良好,检测灵敏度为3.3×10~1 CFU/g,定量的偏差率为+10.18%,证明了ddPCR用于绝对定量检测的可行性,为其他食品污染菌和致病菌标准化控制体系提供有益的示范作用。

微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量

目的运用微滴式数字PCR技术进行生物样品的种属鉴定和绝对定量。方法选择人mtDNA两个编码基因ND4和16S rRNA,设计特异性引物与探针,用人来源及常见动物样本验证种属特异性,再用重组质粒和2组共16份人来源生物检材,倍比稀释。使用微滴式数字PCR技术进行种属检验和绝对定量,验证其灵敏度和稳定性。结果人重组质粒FAM(ND4)可进行人来源样品的检测,其检测结果与各级稀释梯度基本吻合,微滴式数字PCR技术可以检测出反应体系中低至单拷贝的DNA。结论微滴式数字PCR技术可以进行生物样品的种属鉴定和绝对定量,并具有很高的灵敏度和特异性,可应用于日常法医物证检验。

微滴数字PCR技术在多拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌筛选中的应用

为获得高产木聚糖酶酿酒酵母工程菌,利用rDNA整合法构建木聚糖酶酿酒酵母整合表达载体,实现木聚糖酶基因的多拷贝表达,并利用微滴数字聚合酶链式反应技术对转化子拷贝数进行检测,分析木聚糖酶基因拷贝数与酶活力之间的关系。结果表明:利用rDNA整合法获得了10株不同拷贝数木聚糖酶酿酒酵母工程菌,对其酶活力进行测定,发现当拷贝数小于9时,菌株产酶能力随拷贝数增加而增强,9拷贝数时菌株产酶能力最强,酶活力为308 U/m L,超过9拷贝,产酶能力降低。

基于微滴式数字聚合酶链式反应技术检测布鲁氏菌病患者血液中布鲁氏菌核酸的研究

目的本研究旨在建立一种基于微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)的检测方法,能够实现对布鲁氏菌病(布病)患者血液中布鲁氏菌核酸的定量与精准检测。方法以布鲁氏菌Bcsp31基因为靶基因,设计引物与探针并构建pUC57-Bcsp31重组阳性质粒,评价ddPCR方法检测布鲁氏菌的灵敏度、重复性与特异度。此外,收集疑似布病患者血液120份,采用ddPCR方法对样本中布鲁氏菌DNA载量进行定量检测。结果本研究建立的ddPCR检测布鲁氏菌的方法具有很高的灵敏性,最低检出限为100拷贝/μL,并且对布鲁氏菌的检测呈现出良好的特异性与准确性。120份血液样本中,ddPCR方法检出阳性103份,实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法检出阳性52份。105份抗体阳性样本中,ddPCR方法与qPCR方法分别检出阳性93份和51份,阳性率分别为88.57%和49.52%。15份抗体阴性样本中,两种方法分别检测出阳性12份和1份。结论本研究建立了一种基于ddPCR方法的高灵敏度、高特异度的检测布鲁氏菌的方法,能够实现布病患者血液样品中布鲁氏菌核酸的定量与精准检测。尤其对于抗体阴性的疑似患者早期布病筛查具有重要意义。

数字聚合酶链反应及其在感染性疾病中的应用

数字聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)采用与定量PCR相同的荧光化学原理和不同的数学原理来实现对靶标核酸序列的绝对定量,其摒弃了对外部参照的依赖,同时具有更高的数据精密度,提高了重复性和再现性。数字PCR的应用涵盖生命科学众多领域,特别是在医学检验领域,其对疾病相关核酸分子标记的准确分析,为疾病的早期诊断、进展监测、疗效评估提供了动态量化指标。数字PCR的出现将推动基于核酸扩增技术的分子生物学检测迈入精准定量阶段。本文就数字PCR尤其是微滴式数字PCR在感染性疾病中的应用进展及前沿进行综述。

基于液滴微流控技术的集成式数字PCR芯片

为了实现对核酸的高灵敏度检测,设计出一款新型的微滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)芯片。该芯片由流动聚焦式微滴生成模块及后方的微滴储存腔构成。使用COMSOL软件对微滴生成及收集腔内液体流动进行仿真,验证芯片结构的合理性。使用软光刻技术及模压成型方法制得聚合物芯片并进行试验,结果表明,该芯片可以在70s内生成20000个直径为120μm(0.89nL)的微滴,微滴一致性较好(体积的变异系数为2.11%),且可以整齐、稳定地排列在收集腔内。应用该芯片直接进行原位PCR扩增及检测即可得出DNA检测结果。该芯片具有高灵敏度、高通量和高集成度的优势,避免了普通数字PCR的各种缺陷,如操作复杂、移液过程中的样品污染、样品损失、微滴破碎和融合。

一种羊乳粉的微滴式数字PCR定量分析方法

基于市场上对乳品溯源技术的迫切需求,以微滴式数字聚合酶链式反应技术对羊乳粉中的乳源进行准确判别。基因检测技术对判别乳源来源方面克服了成分复杂、检测时间长等的缺点,更加精准地针对本源进行检测,减少了误判的可能性。本实验以羊乳粉质量、DNA质量浓度及其拷贝数为实验指标,建立了以羊乳粉拷贝数与质量的关系式,准确地判断出羊乳粉的质量,其公式为M=(C-4.75)/3.56,其中,M代表羊乳粉的质量(mg),C代表每微升的拷贝数(copies/μL),该方法的建立对现有市场上的羊乳粉定量检测提供了新的方法和思路。