双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法

目的利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法。方法针对新型冠状病毒的特征核壳蛋白N基因和开放阅读框1ab(ORF1ab)基因序列保守区设计引物,获得了RT-LAMP检测体系,并评价该体系的特异性、最低检测限、抗干扰能力和最佳反应时间。结果经检测新型冠状病毒核酸标准物质,其结果与预期相符,证实了该检测体系的可行性。结论利用逆转录环介导恒温扩增技术快速检测新型冠状病毒核酸的反应体系特异性好、灵敏度高,适用于边境条件有限地区。

微流控芯片环介导等温扩增技术检测3种猪圆环病毒

为建立快速区分3种猪圆环病毒(PCV2、PCV3和PCV4)的现场检测方法,采用微流控芯片环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),收集3种猪圆环病毒临床阳性样本进行核酸提取,与市场上3种猪圆环病毒荧光探针法检测试剂盒进行灵敏度、特异性和重复性同步比对。结果显示:微流控芯片LAMP法在3种猪圆环病毒联检测试中具有非常高的灵敏度,可以在30 min内,实现不低于荧光定量PCR法的敏感性;与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒临床阳性样本均无交叉反应,特异性好;测试3种猪圆环病毒重复性Ct值变异系数(CV)均在2%以下,稳定性好。结果表明:3种猪圆环病毒微流控芯片快速联检技术特异性好、灵敏度高、重复性强,检测速度快,环境要求低,可以满足现场检测的要求,适用于养猪场等场所的猪圆环病毒现场快速检测。本方法的建立为猪相关病原体的现场快速核酸检测提供了有力工具。

环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因检测中的应用

该文介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增基因检测技术，该技术分别使用特异对应于靶序列中8个基因区段的3对特殊引物，并在反转录酶和Bst-DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应，整个检测反应只需1～2h。利用这种技术成功检测了丙型肝炎病毒基因，对60份经Real-timePCR或RT—-PCR验证阳性的血清样品检测，阳性符合率为98％。同时，对扩增终产物进一步进行酶切分析，并与HIV、HBV和不同亚型流感病毒RNA进行交叉反应和特异性测试，均与预期结果吻合。将Real-timePCR定量后的RNA系列稀释后对检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示，该技术的检测灵敏度在理论上可达到10个拷贝的RNA分子。以上结果证明，RT-LAMP扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段，在丙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测。该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应。对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green I为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性。此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平。因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法。

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立

根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高,且不需昂贵仪器设备,为快速检测草鱼呼肠孤病毒与诊断草鱼出血病提供了简捷快速的技术手段。

应用环介导逆转录等温扩增技术快速检测新城疫病毒

参考新城疫病毒融合基因(fusion gene,F gene)序列,设计了2对能够特异性地识别F基因上的6个区域的引物,并以此建立了一种简单、快速、有效的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)方法检测NDV.试验结果表明:该方法用时短(2 h内完成)、特异性好而且灵敏度高,最小检测限可达100 pg;对人工发病样品进行鸡胚分离和RT-LAMP检测,二者的阳性符合率高达93.5%;同时采用镁离子沉淀对检测结果进行可视化处理,方便利用肉眼直接观察.

逆转录环介导等温扩增技术在诺如病毒基因检测中的应用

目的建立逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)快速检测诺如病毒的方法。方法采用逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)扩增诺如克病毒特异性基因,并与RT-PCR方法比较。结果与RT-PCR技术相比,RT-LAMP法更加简便快速,能够在等温条件下进行,特异性好,具有更高的灵敏性。结论RT-LAMP方法具有灵敏度高,特异性强,操作简便快速,不需要复杂仪器设备等优点,为临床检测诺如病毒快速简便的新方法。

逆转录环介导等温扩增技术检测H3亚型猪流感病毒

基于环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种用于快速检测H3亚型猪流感病毒的方法。根据GenBank中收录的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因保守区的序列,设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物,建立RT-LAMP反应体系;经优化,确定了最佳的LAMP反应条件。扩增后产物形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀,结果可视。同时用特异性内切酶HhaⅠ对所获得的产物进行酶切鉴定,所得的酶切产物大小与理论值完全符合。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法符合率均达到100%。结果表明,本研究建立的RT-LAMP检测猪流感病毒方法,操作简单,灵敏度高,特异性强,是一种适用于现场诊断的检测技术。

小鼠肝炎病毒逆转录环介导等温扩增检测技术的建立

目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。方法针对MHV核衣壳蛋白基因序列设计6条特异性引物,以MHV基因组RNA为模板,进行RT-LAMP反应。扩增产物通过浊度、SYBR green I荧光染料显色及电泳三种方法观察结果。同时,用限制性内切酶AluI对扩增产物进行酶切鉴定。进行RT-LAMP特异性和敏感性试验。最后用建立的RT-LAMP方法检测55份小鼠临床样本。结果RT-LAMP技术简单快速,等温条件下(65℃)一个小时内即可完成反应。酶切结果证明RT-LAMP产物正确。该技术具有很高的特异性和敏感性,可检测到的MHV RNA最低浓度为0.1 pg/μL,比逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)灵敏10倍。临床样本检测结果显示,与RT-PCR比较RT-LAMP方法的敏感性和特异性分别为100%和83.3%。结论RT-LAMP技术是一种快速、简便诊断方法,该方法检测特异性强、敏感性高,可以成为快速准确检测MHV的有效手段。

改良逆转录环介导等温扩增检测技术快速实时检测H9亚型禽流感病毒

利用改良逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术建立一种快速、灵敏的检测方法用于H9亚型禽流感病毒检测。根据H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区序列中的8个区段设计6条特异性引物,在恒温条件下进行核酸扩增反应,并以琼脂糖凝胶电泳和目视检查绿色荧光两种方法对扩增结果进行判定。结果表明,RT-LAMP的最小检测限为100 fg,灵敏度比PT-PCR高100倍,且与H5亚型、H7亚型禽流感病毒,新城疫病毒(NDV)无交叉反应。目视检查绿色荧光与常规琼脂糖凝胶电泳的判定结果一致。整个扩增检测过程在35 min内即可完成。利用临床样本对RT-LAMP法进行验证,结果与RT-PCR一致。由实时浊度分析得到的标准曲线,计算出临床样本中的病毒质粒拷贝数均在2×107-2×104之间。因此,本研究建立的RT-LAMP方法快速、灵敏、特异性强,是H9亚型禽流感病毒的一种高效检测方法。

应用逆转录环介导等温扩增技术检测大豆种子中烟草环斑病毒

根据烟草环斑病毒(TRSV)外壳蛋白基因序列设计并合成了1组RT-LAMP引物,利用实时浊度仪监测反应过程,初步建立了烟草环斑病毒的RT-LAMP检测方法,并进行了特异性与灵敏度检测。结果显示,RT-LAMP灵敏度与普通RT-PCR法相当,但检测时间明显缩短,1 h即可完成反应。此外,体系中加入钙黄绿素,反应结束后,可通过裸眼观察荧光的有无来判断是否有扩增。对大豆种子中携带的烟草环斑病毒进行了RT-LAMP检测,裸眼判定与仪器监测结果一致。结果证明所建立的TRSV RT-LAMP方法具有快速、特异、灵敏,操作简单的特点,不需复杂仪器设备,适合于TRSV的现场快速检测。

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为更加快速、灵敏地检测草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV),建立环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。根据GenBank中GCRV HZ08等毒株VP6蛋白基因序列设计引物,以GCRV弱毒疫苗株(GCHV-892)总RNA为模板建立RT-LAMP反应,对扩增产物用限制性内切酶PvuⅡ进行酶切鉴定,所得酶切产物大小符合预期值。随后对LAMP反应体系包括Mg2+、dNTPs、甜菜碱(betaine)和内外引物浓度比进行了优化,并以含VP6蛋白基因的重组质粒(pEASY-VP6)为模板考量了该方法的敏感性,结果显示最低检测限为10copies.μL-1,比RT-PCR检测方法敏感10倍。特异性试验表明与白斑综合征病毒(WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)无交叉反应。应用RT-LAMP方法检测16份疑似出血病草鱼,6份病料获得了阳性扩增,与RT-PCR检测结果一致。

逆转录环介导等温扩增技术检测南芥菜花叶病毒

根据南芥菜花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了2组RT-LAMP引物,通过筛选试验,最终确定Ar4组引物为最佳引物,建立了南芥菜花叶病毒的RT-LAMP检测方法。同时,通过实时浊度仪和钙黄绿素分别对检测结果进行了判断。特异性和灵敏度试验结果显示,RT-LAMP方法快速、特异且灵敏,其灵敏度与普通RT-PCR法一致。

基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

目的建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法。方法针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件。用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法。进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较。结果以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应。RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P>0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918)。结论建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测。

逆转录-环介导等温扩增技术结合横向流动试纸条法快速检测肠道病毒

目的建立一种快速特异敏感的肠道病毒检测方法。方法针对肠道病毒保守区基因序列,设计6条逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)特异性引物,经过优化,用毛细管电泳及横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物,建立RT-LAMPLFD检测方法,并与荧光定量PCR法进行比较。结果 LFD与毛细管电泳法检测特异的RT-LAMP扩增产物具有同样的敏感度,RT-LAMP-LFD法检测肠道病毒与其他病毒无交叉反应,最低检出限为10拷贝RNA分子,与荧光定量PCR法检测结果一致性为99.2%。结论建立的RT-LAMP-LFD方法,具有较高的特异性及灵敏度,操作简单、快速且不需要昂贵的仪器设备,适合应用于基层实验室肠道病毒的快速检测。

逆转录环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测草鱼(Ctenopharyngodon idellus)呼肠孤病毒(GCRV)的研究

草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)是一种双链分节段RNA病毒,是引起草鱼出血病的(hemorrhage of grass carp)的病原,目前临床上较为流行的为基因I型和II型GCRV。本研究利用逆转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)进行核酸扩增,通过横向流动试纸条方法(lateral flow dipstick,LFD)进行可视化检测,分别建立了可应用于基因I型和II型GCRV快速检测的RT-LAMP-LFD技术。该技术以基因I型和II型GCRV第六基因为检测靶标,分别设计了2对特异性引物(其中,上游内引物由生物素biotin标记)和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针。结果表明,RT-LAMP最适反应温度为63oC,扩增时间为40min,从核酸扩增到LFD结果判读仅需50min。利用RT-LAMP-LFD可特异性检出基因I型和II型GCRV,而对鲤疱疹病毒II型(Cy HV-2)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、嗜水气单胞菌等鱼类常见病原的核酸检测结果为阴性,而且两种基因型RT-LAMP-LFD方法只能检测本基因型GCRV,特异性良好。该方法最低可检测到1.19pg的基因I型GCRV的RNA,1.88pg基因II型GCRV的RNA,其灵敏度分别比相应的RT-PCR方法高2个数量级和1个数量级。对实际样品的检测结果表明,两种基因型RT-LAMP-LFD方法检测GCRV与普通RT-PCR扩增并测序的结果一致。因此,该方法可快速、特异地检测出GCRV,而且操作简单,费用低且耗时短,不需特殊仪器设备,有望成为GCRV现场检测的常规技术手段。

新城疫病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种新城疫病毒(NDV)的简便、快速、高灵敏度的检测方法,本研究根据NDV融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,在恒温水浴中进行核酸扩增反应,对反应温度、反应时间以及反应液中Mg2+浓度进行优化,获得最佳反应条件,结果经凝胶电泳分析并在可见光下直接观察。整个RT-LAMP检测用时0.5 h,检测敏感度比RT-PCR高100倍,对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒无交叉反应。本研究建立的NDV RT-LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强,操作简单等特点,有望在核酸扩增检测方法中取代RT-PCR技术。

鲑鱼甲病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法研究

鲑鱼甲病毒(Salmonid alphavirus,SAV)是鲑鱼胰脏病(Salmon pancreas disease,PD)病原,主要感染鲑科鱼类,目前在我国尚未分离到。为提高出入境鱼类中的SAV检测效率,根据SAV nsP1基因片段,设计3对特异性引物,建立了检测SAV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。该方法使用25μL反应体系,经优化后的反应温度为65℃,反应时间为1 h,检测限可达10个拷贝数的病毒核酸,且不与传染性鲑鱼贫血病毒、病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒、病毒性神经坏死病病毒、草鱼呼肠孤病毒和鲤春病毒血症病毒的RNA产生交叉反应。在反应体系中加入染料后,反应结果肉眼直接可见。本研究建立的RTLAMP方法是一种特异性强、方便快捷的SAV检测方法,适合SAV的现场初筛和核酸检测。

环介导逆转录等温扩增技术在输血前HCV检测中的应用

目的尝试使用环介导逆转录等温扩增技术用于输血前检测HCV RNA。方法同时采用抗-HCVELISA检测和HCV RT-LAMP检测,比较2者检测结果的差异。结果 2 716例输血前标本,ELISA检测发现19例(0.70%)阳性结果,HCV RT-LAMP检测发现32例(1.18%)阳性结果(P<0.05),2种方法在检测效率上具有显著性差异。RT-LAMP检测在灵敏度上略高于ELISA方法。结论基于HNB颜色反应的环介导逆转录等温扩增技术检测HCV的方法具有快速、灵敏度高的特点。