携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究

为了构建含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力,利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子(phosphoglyceratekinasepromoter,PGK)基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN,采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞,G418筛选出抗性克隆,收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞,在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明;重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后,含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论:逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞,可作为介导T细胞基因转移的重要工具。

逆转录病毒载体设计对ANTI-RAS核酶基因转移效率的影响

将anti-ras核酶基因R8克隆于不同的逆转录病毒载体，并导入逆转录病毒包装细胞系PA317，得到具一次感染性的缺失性病毒，通过测定病毒滴度选择R8基因的高效重组逆转录病毒载体．

谷胱甘肽S－转移酶pi基因与逆转录病毒载体的重组体构建

为了在细胞水平上研究谷胱甘肽Ｓ－转移酶ｐｉ（ＧＳＴ－ｐｉ）基因的表达活性对化学致癌物诱导细胞转化作用的影响及探讨肿瘤基因预防的可能性，作为第一步，本实验构建了ＧＳＴ－ｐｉｃＤＮＡ与逆转录病毒载体ｐＸＴ_１的重组体。

重组逆转录病毒载体GTK的构建及HyTK基因转移的研究

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）导入恶性肿瘤细胞，随后可应用药物９－（１，３－二羟基－丙氧基－甲基）鸟嘌呤（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ＧＣＶ）选择性地杀死肿瘤细胞．将ＨｙＴＫ基因替换逆转录病毒载体ＧｌＮａ中的ｎｅｏ基因，构建成重组逆转录病毒载体ＧＴＫ，转染混合包装细胞（双噬性ＰＡ３１７细胞和单噬性ＧＰ＋Ｅ－８６细胞），通过“乒乓效应”获得高滴度重组病毒．用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞，用ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ筛选出阳性细胞克隆（ＨｙＴＫ＋），经ＰＣＲ方法检测证明ＨｙＴＫ基因已成功地导入肿瘤细胞中，且不含可复制的辅助病毒．分别用不同浓度的ＧＣＶ作用于ＨｙＴＫ－及ＨｙＴＫ＋的Ｂ１６细胞，光镜下观察２４ｈ和４８ｈ后细胞形态及进行活细胞计数．结果表明，ＧＣＶ浓度大于０．

真核表达载体与逆转录病毒介导离体成肌细胞中人神经营养素-3基因转移效果比较

神经营养素3(Neurotrophm 3,NT-3)可防止多种神经元的退化变性。是有临床前景的多肽药物。但由于它不能穿过血脑屏障,利用可高效表达NT-的工程细胞作脑移植是将来实现NT-3治疗中枢神经系统损伤的重要途径经之一。为了解何种方法介导NT-3基因转移效果更好,我们比较了真核表达载体pCMV4与逆转录病毒I XSN介导离体成肌细胞中人NT-3(hNT-3)基因转移后hNT-3 mRNA的表达水平和(?)清液中hNT-3的生物活性。

重组逆转录病毒载体系统的建立及其感染滴度的研究

选择新霉素磷酸转移酶II(NeoR)做为标记基因 ,将重组逆转录病毒载体经包装细胞包装后得到的重组病毒浓缩后 ,应用该重组逆转录病毒载体系统体外感染靶细胞NIH3T3以测定其滴度 ,其滴度可达到 1 0 6。

细胞因子对逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓造血干细胞基因转移效率的影响

本实验探讨细胞因子SCF,IL-3和IL-6对基因转移效率的影响,为临床基因治疗提供可靠依据。以小鼠造血干细胞为靶细胞,应用包装细胞株PA317-GCGPXSN制备病毒上清,实施基因转移,采用FACS,GM-CFU,PCR和Southern blot方法测定基因转移效率。实验结果为:SCF,IL-3,IL-6单用或联合应用后,FACS测定的基因转移效率为0.07％-0.20％,GM-CFU测定的结果为20.4％-46.40％,阳性对照组测定的结果则分别为0.06％和10.92％。结论提示SCF/IL-3,SCF/IL-3/IL-6联合应用能显著提高基因转移效率。

重组TNF－α基因逆转录病毒转移系统的构建

将人ＴＮＦ－αｃＤＮＡ功能片段０．９ｋｂ克隆于逆转录病毒载体ＰＬＪ，构建成重组逆转录病毒载体ＰＬＪ－ＴＮＦ；在磷酸钙介导下，将其导入包装细胞ψＣＲＩＰ和ψＣＲＥ中，经克隆筛选，获得了病毒滴度为１０６ＣＦＵ／ｍｌ能稳定、高效分泌含ＴＮＦ－α基因重组病毒颗粒的细胞株ＰＬＪＣ－５。

新型逆转录病毒载体介导的人多药耐药基因转移小鼠造血干/祖细胞

为探讨逆转录病毒介导的外源基因转导对骨髓造血重建的影响,我们以人多药耐药基因(mdr-1)为报告基因,采用包含Friend脾灶形成病毒(spleen focus-forming vims)和鼠胚胎干细胞病毒序列的新型逆转录病毒载体SF-MDR,以病毒包装细胞与小鼠造血细胞体外共培养法进行基因转染,并对基因转导后造血细胞的体外耐药能力及体内造血重建能力进行了观测。结果表明,该载体可有效地介导mdr-1基因转导,明显提高小鼠骨髓造血细胞对秋水仙素及紫杉醇的耐受能力,对细胞体内造血重建能力没有影响,体内移植8个月后经紫杉醇体内筛选,7/7的小鼠可于外周血细胞基因组DNA中检出外源mdr-1基因的存在。

逆转录病毒载体介导IL-2基因转染人肝细胞的建立及其部分生物学性状

目的 建立ｈＩＬ－２基因修饰的人肝细胞株并探讨对其生物学活性的影响。 方法应用重组逆转录病毒载体ｐＬＮＣＩＬ－２，将ｈＩＬ－２基因导入人肝细胞系Ｌ－０２，观察其形态及克隆形成率的变化，检测细胞培养上清中ｈＩＬ－２的含量，以及进行转染细胞基因组ＤＮＡ ＮｅｏＲ基因片段的ＰＣＲ扩增。结果Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞的增殖速度和克隆形成率低于Ｌ－０２／Ｎｅｏ细胞和Ｌ－０２细胞。Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞的培养液中ｈＩＬ－２的含量达３２ ０００ ｐｇ／１０６ｃｅｌｌｓ·ｄ，并可持续表达１０ ｗｋ以上。从Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞和Ｌ－０２／Ｎｅｏ细胞基因组ＤＮＡ中，均扩增到ＮｅｏＲ基因片段（７９０ ｂｐ）。结论应用重组逆转录病毒载体成功地建立了Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞株，为进一步进行肝细胞移植动物实验奠定了基础。

逆转录病毒介导GM-CSF在造血祖细胞中的基因转移

为了探索GM-CSF基因治疗的可行性,采用逆转录病毒载体介导的基因转移方法将小鼠GM-CSF cDNA逆转录病毒pLXSN/GM转染病毒包装细胞PA317,然后感染富含造血干、祖细胞群体,经含G418的体外半固体造血祖细胞培养,表现出较多的G418抗性CFU-GM生成,用PCR和Southem Blot方法分别检测出转化细胞基因组中整合有Neo^R基因和GM-CSF cDNA,原位杂交显示转化细胞有较强的GM-CSF mRNA表达,在Dexter培养中,GM-CSF修饰组的成熟非粘附细胞计数明显高于对照组(P<0.05).上述结果表明GM-CSF重组逆转录病毒成功地转入造血祖细胞并获得了表达,为下一步体内基因治疗奠定基础.

逆转录病毒载体PLXRN介导的人IL-1Ra在关节滑膜细胞中的表达

目的:建立逆转录病毒介导的人IL-1Ra体外表达体系。方法:应用DNA重组技术,将人IL-1RacDNA片段重组到逆转录病毒质粒pLXRN中,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染原代关节滑膜细胞,用ELISA检测IL-1Ra表达。结果:重组pLXRN-IL-1Ra质粒,经酶切鉴定正确。重组逆转录病毒pLXRN-IL-1Ra滴度可达5.5×104CFU/ml,感染原代关节滑膜细胞后能稳定表达。结论:逆转录病毒能介导人IL-1Ra在关节滑膜细胞中的稳定表达,为下一步开展基因治疗运动创伤性骨关节炎奠定了基础。

四环素调控白喉毒素基因的重组逆转录病毒载体的构建

将毒素基因导入肿瘤细胞内是肿瘤基因治疗一个较有前景的手段[1].白喉毒素(diphtheria toxin,DT)是由白喉杆菌分泌的一种单链多肽毒素,大多数哺乳类细胞均存在这种毒素的受体,其A片段(DTA)毒力特别强,它能催化不可逆转的ADP核糖酰基化,使肽链延长因子Ⅱ失活,从而抑制宿主细胞蛋白合成[2].Gossen等[3]提出了可调控型高表达系统(Tet系统),这为毒素基因治疗肿瘤开辟了新途径.Tet系统可分为 Tet-On和Tet-Off系统,前者的基因表达是在四环素加入后激活,而后者则是在四环素浓度逐渐降低的情况下激活.我们构建携带四环素系统调控的DTA基因的逆转录病毒载体,为进一步探讨肺癌的基因治疗奠定基础.……

应用逆转录病毒载体转染K562细胞株的实验研究

目的:探讨多种细胞因子联合刺激下,逆转录病毒载体对K562细胞的基因转移效率。方法:以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3细胞测定病毒滴度后,取经过SCF、IL-3、IL-6预培养刺激后的K562细胞,实施基因转移,流式细胞仪及PCR方法测定基因转移效率。结果:①病毒滴度为1.9×105CFU/m l;②对照组K562细胞测定的荧光强度数值为0.56%,实验组为77.16%,两者差异有统计学意义(P<0.01)。PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断。结论:细胞因子预刺激后实施基因转移,可有效地将外源基因转移进入K562细胞基因组中。

逆转录病毒载体介导的人白细胞介素10在大鼠心肌细胞的表达

目的：建立一个在大鼠心肌细胞表达人白细胞介素１０（ＨｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１０，ｈＩＬ１０）的重组逆转录病毒载体基因转移系统，为下一步的研究工作做准备。方法：将构建的表达人白细胞介素１０的逆转录病毒重组体ｐＬＸ（ｈＩＬ１０）ＳＮ经ＰＡ３１７细胞包装，Ｇ４１８筛选，ＮＩＨ３Ｔ３细胞进行病毒滴度测定，选滴度最高的克隆（６×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）作为感染大鼠心肌细胞的感染细胞；用重组逆转录病毒感染大鼠心肌细胞，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测转染大鼠心肌细胞ＤＮＡ及ｍＲＮＡ，应用ＥＬＩＳＡ测定ｈＩＬ１０在心肌细胞的表达。结果：外源性ｈＩＬ１０基因已整合到心肌细胞染色体ＤＮＡ并有效地转录和翻译，表达水平最高达１７５５ｎｇ／（１０６ｃｅｌｓ·２４ｈ）。结论：外源性ｈＩＬ１０基因可以转移到大鼠心肌细胞并稳定表达，为今后研究ｈＩＬ１０的作用机制及在治疗疾病中的应用打下了基础。

重组逆转录病毒载体的包装

将 3.7kb的 Lac Z基因片段克隆到含标志基因 Neor的逆转录病毒载体 p LXSN与 p LNCX的多克隆位点 ,构建了含有 Lac Z基因的重组逆转录病毒载体 p LLSN和 p LNCL。在测定了 G4 1 8对包装细胞系PA31 7的最小致死剂量后 (最小致死剂量为 0 .3g/ L) ,通过脂质体 Lipofectin与磷酸钙 2种介质 ,分别将 2种重组逆转录病毒载体导入包装细胞系 PA31 7进行包装 ,并以 0 .3g/ L的 G4 1 8进行筛选 ,得到多个 G4 1 8抗性克隆。经扩大培养、传代 ,分别得到包装 p LLSN与 p LNCL的 2株阳性细胞。电镜下可见阳性细胞的培养上清中具有逆转录病毒形态特征的成熟病毒粒子。本研究为运用逆转录病毒载体系统 。

携带猪β干扰素基因的鸡输卵管生物反应器逆转录病毒载体的构建

为构建携带猪β干扰素基因的鸡输卵管生物反应器逆转录病毒载体 ,用PCR技术扩增了猪 β干扰素基因和卵清蛋白5’调控序列 ,然后将其重组到切除了Phsp70启动子的逆转录病毒载体pLNHX中。用酶切和PCR等方法对重组质粒进行鉴定 ,结果表明 ,卵清蛋白 5’调控序列和猪β干扰素基因已正确克隆至逆转录病毒载体pLNHX中。为进一步制备高滴度、高感染性的逆转录病毒 。

逆转录病毒载体介导人胰岛素样生长因子-I在软骨细胞中的表达

目的探讨逆转录病毒载体介导人胰岛素样生长因子-I(human insulin-like growth factor-I,hIGF-I)体外转染兔软骨细胞后软骨细胞hIGF-I的表达情况及其生物学行为变化。方法将构建的含有目的基因的逆转录病毒载体pLNC-IGF-GFP体外转染兔关节软骨细胞,经G418筛选阳性克隆,采用RT-PCR及免疫化学染色检测转染软骨细胞中hIGF-I的表达情况,并在荧光显微镜下观察标记基因GFP的表达情况。采用MTT法、流式细胞仪、免疫细胞化学染色、二甲基亚甲蓝法及ELISA法对转染hIGF-I后的软骨细胞的增殖能力及表型进行检测。结果 G418筛选后获得的软骨细胞阳性克隆,经RT-PCR和免疫细胞化学检测表明hIGF-1基因在mRNA和蛋白质水平得到稳定表达,荧光显微镜下观察转染的软骨细胞可激发出绿色荧光,证明转染成功。转染软骨细胞株的增殖能力、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的分泌水平,在转染后6 w内均高于同时间点未转染的软骨细胞,差异具有显著性(P<0.05)。结论逆转录病毒载体能有效地将hIGF-I基因转染至兔软骨细胞并获得稳定表达,同时转染后的软骨细胞增生活跃,能够在较长时间维持软骨细胞表型,为进一步研究软骨缺损的组织工程修复和基因治疗打下基础。

GDNF基因逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

应用基因重组技术将大鼠 GDNF c DNA克隆到逆转录病毒载体 p L XSN中 ,用限制性内切酶酶切分析重组质粒p L XSN-GDNF中 GDNF基因的插入方向 ,用 PCR、斑点杂交和 Southern杂交对重组质粒作进一步鉴定。结果表明 :GDNF c D-NA已正确地克隆到逆转录病毒载体 p L XSN中而构建成重组逆转录病毒载体 ,成功构建的真核细胞表达载体可作为基因治疗的高效基因转移载体。本研究为进一步开展 GDNF基因治疗 Parkinson' s disease和 Alzheimer' s disease等中枢神经系统疾病提供了资料。

人NT-3重组逆转录病毒载体及稳定包装细胞系的构建及鉴定

构建并鉴定携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系。方法 :用DNA重组技术将人NT - 3定向克隆入逆转录病毒载体 pLXSN ,并用限制性内切酶进行酶切鉴定 ;磷酸钙转染方法将重组的逆转录病毒转染入包装细胞系PA317,G4 18筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果 :构建的重组逆转录病毒载体可以被限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ切开 ,电泳分离显示两条阳性条带 ,分别出现于 0 .8kb和 5 .9kb处 ;重组载体转染包装细胞 ,经G4 18筛选 ,可形成抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 4× 10 5cfu/ml,提示构建携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系成功。结论 :构建携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对神经系统疾病进行基因治疗的方法。