逆转录病毒载体介导的稳定表达口蹄疫病毒3D基因的BHK21细胞系的建立

【目的】研究口蹄疫病毒RNA聚合酶在BHK-21细胞中的稳定表达状况,为研究RNA聚合酶生物学活性及其基因工程疫苗研制提供科学依据。【方法】从重组质粒pMD18-T-3D扩增口蹄疫病毒3D基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pBPSTR1-3D。用pBPSTR1-3D和pVSV-G双质粒瞬时转染GP2-293包装细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染BHK-21细胞,嘌呤霉素持续筛选12d后获得阳性克隆,并用有限稀释法挑选单个阳性细胞克隆。【结果】应用PCR、RT-PCR技术可从体外反复传代的阳性细胞中扩增到3D基因,证实目的外源基因能转录并被稳定整合进宿主细胞基因组中。经SDS-PAGE、Westernblot、间接免疫荧光检测到在不同代次的阳性细胞中有目的蛋白表达。【结论】本试验利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,将外源基因插入到靶细胞的基因组中,构建了稳定表达口蹄疫病毒RNA聚合酶的包装细胞系,为研究3D基因表达及其蛋白定位提供了方便,也为下一步研究RNA聚合酶生物学功能和疫苗研制提供了科学依据。

人PD-L1(B7-H1)基因克隆及其逆转录病毒载体的构建和稳定表达

目的 :克隆人PD L1(B7 H1)基因 ,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体 ,获得稳定表达PD L1基因的L92 9细胞。方法 :从人心脏cDNA文库中扩增出PD L1基因 ,通过双酶切装入逆转录病毒载体 pGEZ Term中 ,脂质体法共转染包装细胞 2 93T ,用含有完整病毒颗粒的 2 93T细胞的培养上清感染L92 9细胞 ,72h后 ,加入Zeocin进行筛选 ,挑选出能稳定表达PD L1蛋白的L92 9细胞株。结果 :构建了用于表达的含PD L1基因的重组逆转录病毒载体 ;经转染包装细胞 2 93T后 ,包装出具有感染能力的重组PD L1逆转录病毒 ;经RT PCR、流式细胞仪表型检测表明 ,筛选出的L92 9转基因细胞能稳定表达人PD L1蛋白。结论 :构建了含人PD L1基因重组逆转录病毒载体和稳定表达人PD L1蛋白的细胞株 ,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。

pSiRNA-Notch1逆转录病毒载体的构建及对恶性脑胶质瘤细胞的作用

目的建立逆转录病毒介导的人Notch1基因RNA干扰体外表达体系并观察对恶性脑胶质瘤细胞的作用。方法将人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段重组到逆转录病毒质粒Psilencer5.1-H1Retro中,构建成携带人Notch1基因RNAi逆转录病毒载体pSiRNA-Notch1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染U251和CHG-5恶性脑胶质瘤细胞,用WST-8、RT-PCR和Western blot分别检测对转染细胞活性、人Notch1 mRNA和蛋白表达的影响。结果重组pSiRNA-Notch1质粒经测序鉴定正确。重组逆转录病毒滴度可达224×104cfu/ml,感染U251和CHG-5恶细胞后3d能明显抑制细胞生长,RT-PCR和Western blot检测人Notch1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论携带人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段的逆转录病毒有明显的抑制恶性脑胶质瘤细胞生长作用,为下一步开展基因治疗恶性脑胶质瘤奠定了基础。

逆转录病毒载体PLXRN介导的人IL-1Ra在关节滑膜细胞中的表达

目的:建立逆转录病毒介导的人IL-1Ra体外表达体系。方法:应用DNA重组技术,将人IL-1RacDNA片段重组到逆转录病毒质粒pLXRN中,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染原代关节滑膜细胞,用ELISA检测IL-1Ra表达。结果:重组pLXRN-IL-1Ra质粒,经酶切鉴定正确。重组逆转录病毒pLXRN-IL-1Ra滴度可达5.5×104CFU/ml,感染原代关节滑膜细胞后能稳定表达。结论:逆转录病毒能介导人IL-1Ra在关节滑膜细胞中的稳定表达,为下一步开展基因治疗运动创伤性骨关节炎奠定了基础。

逆转录病毒载体介导大鼠乳腺癌细胞共表达MIP-1α和B7-1

目的:建立共表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的大鼠乳腺癌细胞株,并进行体外活性检测。方法:应用含不同选择标记的重组逆转录病毒载体,经1mg/mlG418和2μg/ml puromycin双药物筛选后获得MIP-1α+B7-1基因共表达的大鼠乳腺癌细胞株。RT-PCR、免疫组化检测mMIP-1α的表达,RT-PCR、流式细胞术检测mB7-1的表达;将共表达MIP-1α和B7-1的肿瘤细胞与大鼠脾淋巴细胞混合培养后,MTT法检测淋巴细胞的增殖指数、琼脂糖打孔法检测共表达MIP-1α和B7-1肿瘤细胞对单个核细胞的趋化活性。结果:经脂质体转染包装细胞产生的重组逆转录病毒上清病毒滴度达4.6×107CFU/L。细胞生长曲线显示,重组逆转录病毒感染对乳腺癌细胞增殖无明显影响。重组逆转录病毒感染的大鼠乳腺癌细胞株SHZ-88/mMIP-1α+mB7-1有B7-1和MIP-1α mRNA及蛋白的表达。淋巴细胞增殖指数PI值SHZ-88/PLXSN组为(0.76±0.25),SHZ-88/mMIP-1α+mB7-1组为(1.95±0.31),后者体外刺激淋巴细胞增殖能力增强(P<0.01),SHZ-88/pBabe puro组的趋化指数为(0.99±0.19),mMIP-1α+mB7-1组的为(3.88±0.33),后者显著增强了趋化活性。结论:通过逆转录病毒载体介导建立MIP-1α和B7-1基因共表达的大鼠乳腺癌细胞株具有招引单个核细胞,并将其激活的体外生物学活性。

人MCPH1基因shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MCPH1表达的影响。方法:将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰逆转录病毒载体pSi RNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1 mRNA和蛋白表达的变化。结果:重组pSi RNA-MCPH1质粒经测序鉴定正确;重组逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western印迹检测人MCPH1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论:携带人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MCPH1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。

抑癌基因nm23-H1在逆转录病毒载体的表达

癌症转移是癌症病人死亡的主要原因之一。抑制肿瘤转移的基因ｎｍ２３－Ｈ１与ｎｍ２３－Ｈ２分别编码二磷酸核苷激酶（ＮＤＰＫ）的Ａ与Ｂ亚基〔１〕，ｎｍ２３－Ｈ１基因能有效地抑制肿瘤转移〔２〕。ｎｍ２３－Ｈ１的表达水平与黑色素瘤〔２，３〕、乳腺癌〔４〕、卵巢...

MDR1基因RNAi逆转录病毒载体的构建及表达

目的:构建并鉴定MDR-1基因沉默载体pSUPER-retro-puro-shRNA(MDR1),并检测其对于乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR耐药表型的逆转效果。方法:根据MDR-1基因序列,利用在线软件IDTdna设计2个干扰MDR-1基因的寡聚核苷酸序列,合成回收DNA序列退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和测序分析后,再转染293T包装细胞产生病毒颗粒后感染MCF-7/ADR细胞。用RT-PCR检测MDR1基因mRNA表达,Westernblotting测定转染后MCF-7/ADR细胞中P-gp蛋白的表达量。结果:重组MDR基因沉默载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析证实插入60bp序列与原序列一致,位置正确;与对照组比较,转入MCF-7/ADR细胞后RT-PCR结果显示MDRmRNA水平明显下降,Western blotting显示P-gp蛋白表达量明显降低。结论:逆转录病毒MDR1基因沉默载体构建成功,并在MCF-7/ADR细胞中起到抑制MDR1基因表达的作用。

表达E2F1小干扰RNA的逆转录病毒载体的构建

目的 :建立一个表达E2F1小干扰RNA的靶向抑制E2F1表达的重组逆转录病毒载体。方法 :通过重组DNA技术 ,将设计好的两条互补寡核苷酸片段退火后与载体连接 ,利用载体上的BglⅡ和EcoRⅠ位点进行双酶切初步鉴定 ,重组载体应产生 3 3 2bp和 6182bp两个片段 ,选择酶切正确的重组载体进行测序 ,保证siRNA的方向和序列正确。结果 :表达siRNA的重组逆转录病毒载体构建成功。结论 :重组逆转录病毒载体的成功构建为下一步基因治疗的研究奠定了基础。

可溶性TGF-β_1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA 技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度. 结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系. 结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN, 可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.

逆转录病毒载体介导MGMT和MDR1基因增强人脐血CD34+细胞对联合化疗抗性的研究

为探讨转染六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因(MGMT)和多药耐药基因(MDR1)的人脐血CD34^+细胞能否同时增强对卡氮芥(BCNU)和MDR1基因靶药的抗性,应用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中获得编码六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)cDNA,构建双顺反子逆转录病毒载体G1Na-MGMT-IRES-MDR1,以电穿孔介导的基因转移法导入GP+E86和PA317病毒包装细胞,采用含BCNU和长春新碱(VCR)的培养基克隆选择后收集重组病毒上清于单向型GP+E86与双嗜型PA317包装细胞行乒乓交互感染,将含MGMT和MDR1双耐药基因重组病毒的上清在细胞生长因子刺激下重复感染经免疫磁珠分离系统(MACS)分离纯化后的人脐血CD34^+细胞,用PCR,RT-PCR,Southern blot,Northern blot,FACS和MTT等方法检测外源MGMT与MDR1基因在CD34^+细胞中的转移和表达。结果显示,DNA测序及酶切鉴定证实MGMTcDNA克隆和双顺反子逆转录病毒载体构建的正确性,MACS分离纯化后的人脐血CD34^+细胞纯度平均达92%,回收率为75%,含双耐药基因重组病毒的上清最高滴度为5.8×10~5cfu/ml,逆转录病毒载体介导的双耐药基因已整合入转染靶细胞中基因组并获得有效表达,同时传递不同的耐药表型,应用集落计数、PCR方法测定基因转导效率分别为18%和20%,巢式PCR及补救分析均未检测到辅助病毒存在,经双耐药基因修饰的脐血CD34^+细胞对BCNU的IC_(50)较对照组提高4.5倍,对VCR,柔红霉素(DNR)和秋水仙碱(COL)的IC_(50)较未转染细胞分别高7.8,6.6和5.5倍。本研究对降低联合化疗骨髓毒性作用的肿瘤临床研究奠定了实验基础。

人B7-1、IFN-γ双顺反子逆转录病毒载体的构建和表达

目的 :制备免疫基因修饰的卵巢癌肿瘤疫苗。方法 :利用口蹄疫病毒的内在性核糖体插入位点 (internalribosomeentrysites,IRES) ,通过基因克隆技术构建人B7 1、IFN γ双顺反子逆转录病毒载体PLXSN/B7 1IFN γ。结果 :将PLXSN/B7 1IFN γ转染逆转录病毒包装细胞 ,包装成病毒 ,经滴度测定后 ,转导卵巢上皮癌细胞系 3AO ,筛选稳定表达克隆 ,RT PCR和免疫流式细胞测定均可证实B7 1、IFN γ在同一转导细胞的共表达。结论 :口蹄疫病毒的IRES可提供B7 1、IFN

携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的 :构建携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体。方法 :以逆转录病毒 pRevTRE为载体 ,采用平末端连接法获得含人TGFβ1cDNA3’ -端活性肽编码基因正、反向插入的重组病毒质粒 ,脂质体介导转染包装细胞PA317,获得含TGFβ1正、反义RNA的复制缺陷型逆转录病毒载体 pRevTβ和 pRevTβ-AS ,感染NIH3T3细胞 ,测定病毒滴度。分别转染膀胱癌EJ细胞 ,通过Southern -blot和半定量RT -PCR方法评价载体整合及表达效率。结果 :pRevTβ、pRevTβ-AS载体病毒滴度分别为0.84、0.88×105CFU/ml,EJ细胞外源基因的整合率为100 %,正、反义基因转染细胞内TGFβ1mRNA的相对转录水平为1.89和0.35。结论 :构建的携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体符合细胞体外转染要求 ,能与肿瘤细胞高效整合 ,有效表达。

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ１ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ，以磷酸钙法转染ψ２，ＰＡ３１７包装细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３，细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ，最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。

人IL-1受体拮抗蛋白重组逆转录病毒载体的构建、鉴定及在骨关节炎软骨细胞中的表达

目的构建含人IL-1受体拮抗蛋白(IL-1 receptor antagonist,IL-1Ra)逆转录病毒表达载体(PLXRN-IL-1Ra),体外转染人骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞,研究其相关特性。方法利用细菌内同源重组技术快速构建PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒重组质粒,经测序及酶切鉴定正确后转染PT67细胞,包装成为重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒,并使用小鼠肾成纤维细胞系NIH/3T3对病毒进行滴度测定。实验分为3组:未转染组(A组)、PLXRN空质粒转染组(B组)、PLXRN-IL-1Ra转染组(C组),病毒感染人OA软骨细胞后,RT-PCR检测细胞内IL-1Ra基因的转录和表达;ELISA法检测细胞培养上清液中人IL-1Ra蛋白表达。结果酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒中含有人IL-1Ra cDNA,测定包装的病毒滴度为3×104CFU/mL。原代软骨细胞体外培养呈多角形或梭形,甲苯胺蓝染色见细胞内有紫色异染颗粒。RT-PCR结果显示在C组出现311bp人IL-1Ra mRNA片段,A、B组未见人IL-1Ra mRNA的表达带,GAPDH在各组均有表达。ELISA检测发现C组细胞上清有一定量的人IL-1Ra表达,蛋白浓度为(60.47±15.13)ng/L,A组和B组均无人IL-1Ra表达。结论构建的IL-1Ra逆转录病毒表达载体成功地感染人OA软骨细胞,并在体外获得稳定表达,为将表达人IL-1Ra基因的人OA软骨细胞用于OA基因治疗提供了实验依据。

HIV-1辅受体配体的逆转录病毒载体的构建和表达

目的:构建HIV 1辅受体的配体-趋化因子RAN TES和SDF 1的逆转录病毒载体,并观察在NIH3T3细胞的表 达.方法:从重组质粒pCMV R K S K中获取RANTES KDEL SDF KDEL基因片段,构建RANTES和SDF 1的逆转录病毒 载体pLNCX R K S K,酶切鉴定并测序.采用标准的磷酸钙共 沉淀法转染包装细胞Bing,G418筛选克隆细胞,制备重组病 毒液,继之感染NIH3T3细胞,计算病毒滴度.间接免疫荧光 检测NIH3T3细胞中RANTES、SDF 1的表达.结果:pLNCX R K S K逆转录病毒载体酶切和测序结果与预期一致,筛选 出抗性克隆,制备了高滴度的重组病毒液,间接免疫荧光证实 RANTES和SDF 1可表达于转染细胞.结论:HIV 1辅受体的 配体、趋化因子RANTES和SDF 1的逆转录病毒载体构建成 功,重组病毒可以感染NIH3T3细胞,为下一步HIV 1感染实 验打下了基础.

人抑癌基因 nm23-H_1 在逆转录病毒载体上表达的研究

应用基因工程的方法，将抑癌基因ｎｍ２３－Ｈ１的ＤＮＡ片段克隆到逆转录病毒表达载体ｐＬＸＳＮ，得到重组质粒ｐＬＸＳＮ－ｎｍｈ１。用磷酸钙沉淀技术将重组质粒转染到辅助包装细胞ψＣＲＩＰ中，通过Ｇ４１８筛选，得到抗性克隆。经ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ杂交检测证实：ｎｍ２３－Ｈ１基因已整合到克隆细胞的染色体上，并且得到表达。获得的逆转录病毒滴度达１０５ＣＦＵ／ｍＬ。

Islet-1基因逆转录病毒表达载体的构建

目的:分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1(Islet-1)基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法:利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1TA中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其导入包装细胞PA317中,经G418筛选后,获得阳性克隆。结果:RT-PCR产物为1050bp条带,经测序鉴定与GenBank中Islet-1基因的序列相同;构建的plEGFP-C1-Islet-1载体经酶切鉴定,证实Islet-1基因片段正确插入逆转录表达载体中。用共聚焦激光扫描显微镜观察导入Islet-1基因的PA317细胞,可见细胞发出绿色荧光。结论:分离得到了大鼠Islet-1基因并成功构建了plEGFP-C1-Islet-1表达载体。

表达小鼠CD1_D基因的重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达小鼠CD 1D基因的重组逆转录病毒载体并加以酶切鉴定。方法提取小鼠脾总RNA进行RT-PCR反应获基因,酶切真核表达载体得到目的基因,定向克隆连接到逆转录病毒载体上,得到重组逆转录病毒载体,使用酶切方法加以鉴定。结果酶切所得片段与所需相符,经测序证明为所需载体。结论获得重组的逆转录病毒载体,为今后进一步的研究奠定基础。