重组腺病毒AdKDR-TK联合IL-12逆转录病毒血管靶向治疗裸鼠皮下人肝癌细胞移植瘤的实验研究

目的探讨重组腺病毒AdKDR-TK联合IL-12逆转录病毒通过血管靶向治疗裸鼠皮下人肝癌细胞移植瘤的疗效及作用机制。方法 SCID小鼠腋部皮下植入1×107(0.2mL)HepG2细胞,同时腹腔注射PBL2×107(0.5mL),当瘤体达0.5cm3时,随机分成4组,分别为更昔洛韦(GCV)组(第I组)、IL-12逆转录病毒组(第Ⅱ组)、重组腺病毒AdKDR-TK组(第Ⅲ组)及重组腺病AdKDR-TK联合IL-12逆转录病毒组(第Ⅳ组)。各治疗组瘤内分别注入重组病毒液或/及重组逆转录病毒液0.1mL,第二天重复注射一次,重组腺病毒治疗在病毒给予24h后分别在腹腔内注射GCV,连续l0d;对照组腹腔内注入GCV。观察各组瘤体生长情况及免疫组化法测定肿瘤微血管密度(MVD)。结果第Ⅳ组经治疗后肿瘤的生长受到明显的抑制,其抑瘤率为62.14%,与第II组及Ⅲ组比较,后两者的抑瘤率分别为18.32%和32.73%(与第IV组比较,两者P<0.01)。肿瘤组织内的MVD,第I组为(40.1±6.7)个/mm2、第II组为(32.2±7.3)个/mm2、第III组为(27.6±7.1)个/mm2、第Ⅳ组为(7.7±4.1)个/mm2,其中第Ⅲ组与第Ⅱ组(P<0.05)、第Ⅳ组与第Ⅱ组(P<0.01)、第Ⅳ组与第Ⅲ组(P<0.01)之问的肿瘤内MVD比较均有统计学差异。结论 IL-12逆转录病毒能够增强重组腙病毒介导以KDR为启动子的胸苷激酶系统的血管靶向性地有效抑制肿瘤的生长。

mIL-12重组逆转录病毒载体的构建及包装细胞系的建立

目的:构建mIL-12重组逆转录病毒载体。方法:将mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒。结果:重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞后的上清感染NIH3T3细胞后,经共聚焦显微镜能观察到融合蛋白的表达。结论:包装细胞上清中有含mIL-12 DNA的重组逆转录病毒,mIL-12重组逆转录病毒可感染NIH3T3细胞并在细胞中进行有效的复制。

IL-17和siRNA-IL-17基因逆转录病毒载体的构建及其转染致糖尿病性T细胞中IL-17的表达

目的构建含有Thy1.1细胞表面抗原(Thy-1.1cell surface antigen,Thy1.1)基因的携带IL-17或siRNA-IL-17基因的逆转录病毒载体,并观察逆转录病毒对致糖尿病性BDC2.5T细胞的转染能力。方法利用基因工程和细胞克隆技术分别将IL-17的cDNA插入MSCV-IRES-Thy1.1(MIT)逆转录病毒载体,将Thy1.1、U6增强子(U6promoter)基因和IL-17的siRNAcDNA插入逆转录病毒载体pMND-BANSHEE,采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染293包装细胞;收集病毒上清,转染预先活化的NOD/BDC小鼠脾细胞,测定致糖尿病性T细胞的IL-17和siRNA-IL-17的表达。结果流式细胞术检测显示,成功构建携带IL-17和siRNA-IL-17的逆转录病毒载体。携带IL-17或siRNA-IL-17逆转录病毒分别感染原代培养并活化的NOD/BDC脾细胞,在空白对照组、空载体组、阳性对照组、IL-17组和siRNA-IL-17组,Thy1.1+/Thy1.2+细胞比例分别为(0.6±0.3)%,(7.2±2.4)%,(6.8±2.6)%,(6.4±2.4)%和(4.6±1.8)%;体外实验携带IL-17基因逆转录病毒转染BDC2.5T淋巴细胞后,IL-17的表达显著高于siRNA-IL-17转染组和未转染对照组(均P<0.01)。体外培养活化实验显示,携带IL-17逆转录病毒转染非活化组和活化组T淋巴细胞,转染后IL-17的表达均显著高于siRNA-IL-17转染组和未转染对照组(均P<0.01),其中IL-17转染活化组的IL-17的表达较非活化组更高(P<0.01);在siRNA-IL-17转染的非活化组和活化组,IL-17的表达显著降低,与未转染对照组相比无显著性差异(均P>0.05)。结论逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因IL-17或siRNA-IL-17转移至BDC/NODT细胞,可作为介导T细胞基因转移的重要工具。

逆转录病毒载体PLXRN介导的人IL-1Ra在关节滑膜细胞中的表达

目的:建立逆转录病毒介导的人IL-1Ra体外表达体系。方法:应用DNA重组技术,将人IL-1RacDNA片段重组到逆转录病毒质粒pLXRN中,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染原代关节滑膜细胞,用ELISA检测IL-1Ra表达。结果:重组pLXRN-IL-1Ra质粒,经酶切鉴定正确。重组逆转录病毒pLXRN-IL-1Ra滴度可达5.5×104CFU/ml,感染原代关节滑膜细胞后能稳定表达。结论:逆转录病毒能介导人IL-1Ra在关节滑膜细胞中的稳定表达,为下一步开展基因治疗运动创伤性骨关节炎奠定了基础。

逆转录病毒介导IL-2基因转移对K562细胞增殖周期的影响

应用逆转录病毒载体将IL-2基因导入人红白血病细胞系K562细胞中。转导18天后,细胞DNA周期分析发现空载体转导的细胞K562/neo及含IL-2基因载体转导的细胞k562/IL-2的G0/G1期比例降低,而G2+M期增高。转导30天后K562/neo DNA周期分布恢复至转导前水平,而K562/IL-2细胞G0/G1期比例仍低于未转导细胞,G2+M期仍高于未转导细胞。MTT法检测细胞增殖活性观察到K562/IL-2从培养第4天起增殖活性明显落后于未转导细胞,核分裂指数亦低于水转导细胞。光学显微镜观察见K562/IL-2细胞中出现较多巨大细胞及多核巨细胞,细胞核数目可多达20余个,推测多核巨细胞的形成可能与细胞核反复分裂而胞质不能分裂有关。进一步形态计量学分析证实IL-2基因修饰的K562细胞体积增大,巨大细胞出现率显著高于未转导的K562细胞。结果提示K562/IL-2细胞体积增大与G2+M期细胞比例增高有关,推测IL-2基因修饰可能导致K562细胞周期滞留于G2期。

逆转录病毒介导白细胞介素12及白细胞介素2基因联合治疗大鼠肝癌

目的 :研究携带小鼠白细胞介素 12 (m IL- 12 )和人白细胞介素 2 (h IL- 2 )基因的逆转录病毒包装细胞株对大鼠肝癌进行联合基因治疗的可行性和疗效。 方法 :构建携带 m IL- 12基因、h IL- 2基因及 m IL- 12 +h IL- 2基因的逆转录病毒包装细胞PA317- GCIL12 EXPN、PA317- GCXEIL2 PN和 PA317- GCIL12 EIL2 PN,分别与肝癌细胞 CBRH3以 1∶ 1混合接种于大鼠腹腔。观察其生存时间。 结果 :生理盐水对照组、空载体对照组 (PA317- GCXEXPN)和 h IL - 2治疗组的平均生存时间分别为(8.5± 1.2 ) d、(8.3± 0 .9) d和 (16 .7± 1.7) d;m IL - 12治疗组和 m IL - 12 +h IL - 2治疗组均长期存活。逆转录病毒包装细胞与CBRH3的比例为 1∶ 10 0混合时 ,m IL - 12 +h IL - 2治疗组仍能长期存活 ,而 m IL - 12治疗组平均生存时间为 (15 .7± 1.8) d。腹腔接种 CBRH3后 1、3、5、7d,采用 m IL- 12 +h IL- 2治疗后 35 d生存率分别为 10 0 %、10 0 %、30 %、15 %。 结论 :携带 m IL- 12和 h IL - 2基因的逆转录包装细胞株可明显抑制肝癌细胞的生长 ,早期治疗优于晚期治疗 。

逆转录病毒介导的小鼠IL-23基因在小鼠结肠癌细胞中的表达及其抗肿瘤活性

目的: 获得表达小鼠IL -23 (mIL- 23 )基因的小鼠结肠癌细胞株。方法: 应用逆转录病毒载体, 将mIL -23基因导入小鼠结肠癌细胞株Colon26, 经G418筛选后获得表达mIL 23的阳性细胞克隆(Colon26 /IL- 23)。用PCR和RT -PCR检测目的基因的表达, 用ELISA法检测mIL -23的产生及mIL- 23诱导的小鼠脾细胞IFN -γ的产生, 用MTT比色法检测Co lon26 /IL -23细胞和Colon26细胞的体外增殖。将Colon26 /IL- 23细胞接种于BALB/c小鼠的右侧背部皮下, 观察其致瘤性。结果: 建立了可表达mIL -23基因的小鼠结肠癌细胞株。分泌至培养上清中的IL -23, 可诱导小鼠脾细胞产生IFN- γ。在体外Colon26 /IL- 23细胞的生长与Colon26细胞无明显不同, 但其在体内的致瘤性下降, 具有抗瘤作用。结论: Colon26 /IL- 23细胞可分泌IL -23并证明其具有抗瘤活性。

人IL-1受体拮抗蛋白重组逆转录病毒载体的构建、鉴定及在骨关节炎软骨细胞中的表达

目的构建含人IL-1受体拮抗蛋白(IL-1 receptor antagonist,IL-1Ra)逆转录病毒表达载体(PLXRN-IL-1Ra),体外转染人骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞,研究其相关特性。方法利用细菌内同源重组技术快速构建PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒重组质粒,经测序及酶切鉴定正确后转染PT67细胞,包装成为重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒,并使用小鼠肾成纤维细胞系NIH/3T3对病毒进行滴度测定。实验分为3组:未转染组(A组)、PLXRN空质粒转染组(B组)、PLXRN-IL-1Ra转染组(C组),病毒感染人OA软骨细胞后,RT-PCR检测细胞内IL-1Ra基因的转录和表达;ELISA法检测细胞培养上清液中人IL-1Ra蛋白表达。结果酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒中含有人IL-1Ra cDNA,测定包装的病毒滴度为3×104CFU/mL。原代软骨细胞体外培养呈多角形或梭形,甲苯胺蓝染色见细胞内有紫色异染颗粒。RT-PCR结果显示在C组出现311bp人IL-1Ra mRNA片段,A、B组未见人IL-1Ra mRNA的表达带,GAPDH在各组均有表达。ELISA检测发现C组细胞上清有一定量的人IL-1Ra表达,蛋白浓度为(60.47±15.13)ng/L,A组和B组均无人IL-1Ra表达。结论构建的IL-1Ra逆转录病毒表达载体成功地感染人OA软骨细胞,并在体外获得稳定表达,为将表达人IL-1Ra基因的人OA软骨细胞用于OA基因治疗提供了实验依据。

逆转录病毒介导的小鼠IL-23基因在鼠高转移性乳腺癌细胞系MA-891中的表达

目的:建立表达小鼠IL-23基因的鼠乳腺癌细胞系IL-23/MA-891,探讨外源性IL-23基因对MA-891细胞生长及其生物学性状的影响。方法:将插入IL-23基因的质粒,应用逆转录病毒载体LXSN经感染ψ2(ecotropic)和PA317(amphotropic)两种包装细胞包装,经G418筛选获得表达IL-23分子的PA317阳性细胞克隆,用IL-23/PA317培养上清转染MA-891细胞,获得表达IL-23的IL-23/MA-891细胞。分别用RT-PCR法、ELISA法和免疫组化染色法分析IL-23/MA-891细胞表达IL-23的mRNA和蛋白的水平,筛选出高表达IL-23的IL-23/MA-891细胞克隆用于下层研究中;用流式细胞仪检测MA-891细胞中MHCⅠ、MHCⅡ、CD80、CD86以及FAS蛋白的表达、细胞周期变化及细胞凋亡情况;用ELISA法检测IL-23/MA-891细胞培养上清诱导脾细胞分泌IFN-γ的能力,用MTT比色法检测细胞增殖反应。结果:外源性IL-23基因转染的小鼠乳腺癌细胞系IL-23/MA-891,在mRNA水平和蛋白水平均可获得稳定表达;IL-23/MA-891细胞与LXSN/MA-891和MA-891比较,细胞周期及细胞凋亡率无显著性差异(P>0.05),H-2Kb(MHCⅠ类分子)、I-Ab(MHCⅡ类分子)、CD80、CD86以及FAS蛋白的表达水平无显著性差异(P>0.05);IL-23/MA-891细胞的增殖反应与LXSN/MA-891和MA-891细胞相比虽有所降低,但无显著性差异(P>0.05)。然而,IL-23/MA-891细胞的培养上清可明显促进小鼠脾细胞分泌IFN-γ(P<0.01)。结论:建立的稳定表达IL-23的IL-23/MA-891细胞,具有较强的免疫学调节活性,其生物学形状与MA-891和LXSN/MA-891细胞相比较没有明显差异,但可进一步用于肿瘤相关免疫基因治疗的研究。

逆转录病毒载体介导IL-6基因修饰大肠癌细胞的抗瘤效应

目的：将外源性IL-6基因导入大肠癌细胞，建立IL-6基因表达株，观察IL-6转基因表达对大肠癌细胞的体内外抑制作用。方法：参照分子克隆技术将构建成功的重组逆转录病毒载体pZIPIL-6cDNA转染PA317包装细胞，以G418筛选抗性细胞，常规制备重组病毒液并感染大肠癌HT-29细胞，采用Northern Blot分析基因转录水平，ELISA法和MTT显色法检测蛋白表达的量与活性，以细胞生长曲线和集落形成实验以及棵鼠移植瘤实验观察转导株的体内外抑瘤作用。结果：制备了高滴度的重组病毒液(5.1×10^5cfu／ml)，建立了稳定表达IL-6的转导细胞(HT-29IL-6)，表达的量与活性分别为1132.5pg/ml/10^6cells 24h与150U／ml，转导株的细胞群体倍增时间为2．5天，对数生长期在4～7天之间,集落形成率和抑制率分别是2．21%和50％，接种裸鼠皮下的出瘤时间为13．5天,最终瘤体直径在6．5～8.5mm之间，移植瘤标本镜下可见大量凋亡细胞，以上结果与非转导株HT-29细胞相比．均有显著差异。结论:通过逆转录病毒载体的介导，IL-6基因能稳定整合在靶细胞染色体并进行有效的转录表达，IL-6转基因表达可明显抑制大肠癌细胞的体外增殖和体内移植瘤的形成与发展。

逆转录病毒载体PLIL-2SN转导人CD_3AK细胞方法的建立

目的 :探讨CD3AK细胞在基因治疗中的应用 ,并对逆转录病毒载体转导CD3AK细胞IL 2基因的方法进行研究。方法 :利用逆转录病毒载体PLIL 2SN向人CD3AK细胞中导入IL 2基因。结果 :从转导细胞中RT PCR扩增出 347bpNeoR 基因特异性片段 ,并测出培养上清液中IL 2浓度为 3 .2 76 μg·L-1。结论 :转导的IL 2基因得到表达 ,转导成功。这有助于进一步研究转导后淋巴细胞的功能 。

逆转录病毒载体介导的人IL—2基因转染白血病细胞的初步研究

应用逆转录病毒载体ＬＮＣＩＬ－２介导答ＩＬ－２基因转染人白血病细胞株Ｋ５６２，ＨＬ－６０，并获得稳定表达；观察到转染ＩＬ－２基因后的Ｋ５６２，ＨＬ－６０细胞，的生长速度明显落后于未转该基因或转染突载体的Ｋ５６２，ＨＬ－６０细胞。

构建人白细胞介素2逆转录病毒载体和包装细胞

目的：构建人白细胞介素２（ｈＩＬ－２）逆转录病毒载体及包装细胞。方法：用基因重组法将ｈＩＬ－２ｃＤＮＡ与ｐＬＮＣＸ重组成正义和反义ＬＮＣＩＬ－２基因。用磷酸钙－甘油法及感染法将ＬＮＣＩＬ－２基因转入ＰＡ３１７包装细胞内。所得克隆Ａ８的ｈＩＬ－２分泌量，ＤＮＡ、ＲＮＡ分别用ＥＬＩＳＡ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交法分析。结果：Ａ８分泌的ｈＩＬ－２量为８．４ｎｇ·（２４ｈ·１０６细胞）１，ｈＩＬ－２基因完整地整合到转导细胞基因组内并有ｈＩＬ－２ｍＲＮＡ表达，细胞上清内病毒滴度为１０６·ＣＦＵ·ｍｌ１。结论：本研究成功地构建编码ｈＩＬ－２的逆转录病毒载体，并筛选出能产生病毒粒子、分泌ｈＩＬ－２的包装细胞。

逆转录病毒载体介导的RNA干扰稳定抑制肌肉生长抑制素GDF-8的表达

为将肌肉生长抑制素的干扰序列表达盒hU6-siGDF-8有效导入肌成纤维细胞C2C12中,以pAV-hU6+27载体为基础构建逆转录病毒载体pXSN-hU6-siGDF-8,并使之与pVSV-G质粒共转染GP-293细胞,用包装出的病毒粒子感染宿主细胞C2C12,G418筛选稳定整合逆转录病毒的抗性细胞库。2周后,Western Blotting和Real-Time PCR分析结果显示,细胞内源性的GDF-8基因的表达得到了有效的抑制;MTT法和细胞流式仪分析表明,G418抗性细胞得到了更有效的增殖,并且G_0/G_1期细胞数量减少了13.7%,S期细胞数量增加了14.9%。因此,逆转录病毒载体的RNA干扰系统可以稳定抑制GDF-8基因表达,它将成为治疗肌肉萎缩疾病的一个强有力的工具。

丙型肝炎患者血清IL-6、IL-12与血清HCV病毒载量及ALT的相关性研究

目的通过对丙型肝炎患者血清IL-6和IL-12与血清HCV病毒载量及ALT的相关性研究,探讨细胞因子在丙型肝炎发病的作用。方法检测43例丙型肝炎患者血清ALT,用Roche荧光定量PCR系统检测其血清HCV病毒载量,用ELISA法测定血清IL-6和IL-12的水平。同时测定20例健康对照者的血清IL-6、IL-12及血清ALT水平。结果丙型肝炎患者组血清IL-6和IL-12水平显著高于正常对照组(P<0.01)。丙型肝炎患者血清IL-6和IL-12水平与血清HCV病毒载量呈正相关。丙型肝炎患者血清IL-6和IL-12水平与ALT呈正相关。结论IL-6和IL-12与丙型肝炎关系密切,免疫损伤可能是丙型肝炎的发病机制中重要原因之一。

轮状病毒肠炎IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α的变化及意义

目的探讨婴幼儿轮状病毒肠炎白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平变化及意义。方法采用ELISA双抗体夹心法检测轮状病毒肠炎患儿及正常对照组血清、大便上清液IL-1β、IL-6、IL-12以及TNF-α水平。结果急性期轮状病毒性肠炎患儿的血清和大便IL-1β、IL-6、IL-12以及TNF-α均高于对照组(P<0.05)。中、重症组急性期血清和大便IL-1β、IL-6、IL-12以及TNF-α显著高于轻症组(P<0.05)。恢复期各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论轮状病毒感染后周围血循环和肠粘膜局部产生IL-1β、IL-6、IL-12以及TNF-α。IL-1β、IL-6、IL-12以及TNF-α在RV感染的免疫防御保护和免疫损伤机理中可能起重要作用。

轮状病毒肠炎IL-12的变化及意义

目的 :探讨婴幼儿轮状病毒肠炎白介素 12 (IL 12 )的水平变化及意义。方法 :采用ELISA双抗夹心法检测轮状病毒肠炎患儿及正常对照组血清、大便上清IL 12水平。结果 :急性期和恢复期血清IL 12水平〔(37 5 5± 12 18)pg ml和 (5 4 15±16 38)pg ml〕均显著高于对照组〔(2 7 30± 14 0 6 )pg ml,P <0 0 1〕。急性期大便IL 12检出率 78 95 % (30 38) ,中位数M =19 95pg ml,恢复期及对照组大便IL 12均未测出 (<10pg ml)。中重症组急性期大便IL 12显著高于轻症组 (P <0 0 5 ) ,轻症组与中重症组急性期和恢复期血清IL 12均无显著差异 (P >0 0 5 )。发病 5天后轮状病毒转阴组急性期血清和大便IL 12水平均显著高于未转阴组 (P <0 0 5 ) ,恢复期两组之间差异无统计学意义 (P >0 0 5 )。结论 :轮状病毒感染后周围血循环和肠粘膜局部产生IL 12。IL 12主要参与轮状病毒肠炎的免疫保护作用。

重组腺病毒Ad5F35-IL-12感染不同单核-巨噬细胞的研究

目的确定人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12在不同人单核-巨噬细胞中的表达。方法将人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12分别感染人外周血单个核细胞、胸水巨噬细胞,以及THP-1和U937单核细胞株及其经佛波酯(PMA)诱导后生成的巨噬细胞;感染48 h后荧光显微镜观察对相应细胞的感染效率,RT-PCR检测IL-12双亚基p35和p40的mRNA表达情况,ELISA检测细胞培养上清中IL-12p70的分泌水平。结果人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12可成功感染人外周血单个核细胞、胸水巨噬细胞以及THP-1和U937单核细胞株及其PMA诱导后生成的巨噬细胞,并分泌IL-12 p70蛋白,蛋白表达量从高至低依次是胸水巨噬细胞、PMA诱导后U937细胞、PMA诱导后THP-1细胞、U937细胞、外周血单个核细胞、THP-1细胞。结论人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12可以感染不同的单核-巨噬细胞,并成功表达分泌IL-12 p70蛋白。

IL-12和IL-4水平对观察和预测拉米夫定治疗乙肝病毒感染中发生YMDD变异的意义

目的:探讨在拉米夫定治疗乙型肝炎病毒感染中发生YMDD变异与治疗期间血清IL-12和IL-4水平变化的关系.方法:慢性乙型病毒性肝炎患者给予口服拉米夫定治疗1a时发生YMDD变异和未发生YMDD变异各选择40例,测定拉米夫定治疗后3、6、12mo血清IL-12、IL-4水平、乙肝两对半、肝功能和HBVDNA.结果:在无YMDD变异组患者中,血清IL-12和IL-4水平在治疗后各个时间点较治疗前均有统计学差异(IL-12治疗后3,6,12movs治疗前,t=2.691,2.351,2.158,P=0.02,0.03,0.04;IL-4治疗后3,6,12movs治疗前,t=2.653,2.107,2.234,P=0.02,0.04,0.03),表现为IL-12水平升高,IL-4水平降低;在YMDD变异组患者中,血清IL-12和IL-4水平仅治疗后3mo和治疗前相比有统计学差异(t=2.104,2.142,P=0.04,0.04),表现为IL-12水平升高,IL-4水平降低.YMDD变异组治疗后3mo和无变异组治疗后同一时间相比,其变化幅度小,且有统计学差并(IL-12:t=2.029,P=0.04;IL-4:t=2.028,P=0.04).结论:发生YMDD变异与治疗期间血清IL-12和IL-4水平变化有关,治疗期间其水平变化小而短暂者有更大的机会发生YMDD变异,动态检测血清IL-12和IL-4水平可以作为拉米夫定治疗乙型肝炎病毒发生YMDD变异的预测指标之一.

人乳头瘤病毒16型E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性

为了研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)防治性疫苗,分析了HPV16 E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性。将构建的pcDNA3.1(+)/E5与pcDNA3.1(+)/IL-12联合免疫BALB/c小鼠,以ELISA测定小鼠血清中抗HPV16 E5 IgG水平、小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量;MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应。结果显示末次免疫后,联合基因疫苗组和单基因疫苗组血清IgG A450值分别明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P<0.01);且联合基因疫苗组显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组的IFN-γ和IL-4含量分别均明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组IFN-γ和IL-4含量(P<0.01),且联合基因疫苗组含量显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组脾淋巴细胞刺激指数(SI)分别显著高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P<0.01);联合基因疫苗组与单基因疫苗组比较,SI差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明HPV16 E5单基因疫苗以及与IL-12联合基因疫苗均能刺激机体产生较强的免疫应答,且联合基因疫苗优于单基因疫苗。